Całkowity potencjał antyoksydacyjny (CPA) opisuje właściwości antyoksydacyjne złożonych&nbsp;układów biologicznych (takich jak ekstrakty ziół czy osocze krwi) często lepiej niż stężenia&nbsp;wszystkich antyoksydantów zawartych w próbce mierzonych oddzielnie. W pracy przedstawiono&nbsp;i porównano metody wyznaczenia CPA odniesione do różnych wolnych rodników. Metody te&nbsp;wykorzystują termolabilny związek AAPH [2,2’-diazobis (2-amidinopropan) dichlorowodorku],&nbsp;generujący rodniki peroksylowe, reakcję Fentona, w wyniku której wytwarzane są rodniki hydroksylowe&nbsp;i SIN-1 (3-morfolino-sydnonimin) generujący nadtlenoazotyny. Rodniki te utleniają analizowane próbki i tzw. „detektor”. Próbka współzawodniczy z detektorem w reakcji z wolnymi&nbsp;rodnikami, co opóźnia pojawienie się sygnału detektora. Opóźnienie to, zależne od stężenia antyoksydantów&nbsp;w próbce, stanowi podstawę analizy wyników. Pomiary CPA, odnoszące się do różnych wolnych rodników, wykonano na próbkach ekstraktów ziół i napojów alkoholowych

Głód, Bronisław K.

Konior, Anna

Kowalski, Cezary

Pomorska, Małgorzata

English

Czasopisma Uniwersytetu Przyrodniczy w Lublinie

A N N A L E S  U N I V E R S I T A T I S  M A R I A E  C U R I E - S K Ł O D O W S K A  L U B L I N  –  P O L O N I A  VOL. LXI, 6 SECTIO DD  2006 *Zakład Farmakologii Katedry Przedklinicznych Nauk Weterynaryjnych  Akademii Rolniczej w Lublinie **Instytut Przemysłu Misnego i Tłuszczowego, ul. Jubilerska 4, 04-190,Warszawa    CEZARY  KOWALSKI*,  MAŁGORZATA  POMORSKA*,  BRONISŁAW  K. GŁÓD**,  ANNA  KONIOR**    Zastosowanie metody fluorymetrycznej do oszacowania  całkowitego potencjału antyoksydacyjnego  Total antioxidant potential measurement using improved fluorometric assay STRESZCZENIE Całkowity potencjał antyoksydacyjny (CPA) opisuje właciwoci antyoksydacyjne złoonych układów biologicznych (takich jak ekstrakty ziół czy osocze krwi) czsto lepiej ni stenia wszystkich antyoksydantów zawartych w próbce mierzonych oddzielnie. W pracy przedstawiono i porównano metody wyznaczenia CPA odniesione do rónych wolnych rodników. Metody te wykorzystuj termolabilny zwizek AAPH [2,2’-diazobis (2-amidinopropan) dichlorowodorku], generujcy rodniki peroksylowe, reakcj Fentona, w wyniku której wytwarzane s rodniki hydro-ksylowe i SIN-1 (3-morfolino-sydnonimin) generujcy nadtlenoazotyny. Rodniki te utleniaj analizowane próbki i tzw. „detektor”. Próbka współzawodniczy z detektorem w reakcji z wolnymi rodnikami, co opónia pojawienie si sygnału detektora. Opónienie to, zalene od stenia anty-oksydantów w próbce, stanowi podstaw analizy wyników. Pomiary CPA, odnoszce si do ró-nych wolnych rodników, wykonano na próbkach ekstraktów ziół i napojów alkoholowych.  Słowa kluczowe: wolne rodniki, antyoksydanty, całkowity potencjał antyoksydacyjny, fluorymetria WSTP Wolne rodniki s uwikłane w patogenez wielu chorób, w tym nowotworów, chorób Alzhei-mera i Parkinsona, czy te miadycy. Maj take znaczcy udział w procesach degeneracyjnych, zachodzcych w komórkach w czasie ich starzenia si i mierci [Halliwell 1994, Głód i in. 2000]. Obserwowane w patologii zmiany w steniach antyoksydantów s wynikiem ich współdziałania z wolnymi rodnikami. W literaturze przedmiotu s opisy wielu metod wyznaczenia stenia ka-dego z wolnych rodników [Głód i in. 2000]. Mona oznaczy stenia poszczególnych antyoksy-dantów, wydaje si jednak, e oszacowanie całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA) jest zdecydowanie bardziej uyteczne [Valkonem i Kuusi 1999, Malinka i in. 2002]. Współdziałanie midzy rónymi antyoksydantami skutkuje czsto lepsz ochron ni mona by sdzi po własno-ciach antyoksydacjnych poszczególnych zwizków. Przykładem moe by glutation, który rege-neruje askorbinian czy sam kwas askorbinowy, odtwarzajcy -tokoferol [Halliwell 2000]. Warto C.  KOWALSKI, M. POMORSKA, B.K. GŁÓD, A.  KONIOR  56 zaznaczy, e stres oksydacyjny i całkowity potencjał antyoksydacyjny s to wielkoci skorelowa-ne ze sob. Zdolno do wymiatania wolnych rodników jest rónie definiowana, a samo zjawisko jest te rónie nazywane (TAC – total antioxidant capacity, FRAP – ferric reducing ability of plasma, TRAP – total redox antioxidant potential, ORAC – oxygen radical absorbance capacity, TEAC – trolox-equivalent antioxidant capacity czy TAR – total antioxidant reactivity) [Buhmann i in. 2004]. W tej pracy bdzie uywana nazwa całkowity potencjał antyoksydacyjny, CPA. Metody pomiaru CPA zostały opracowane do oszacowania zdolnoci antyoksydacyjnej złoonych próbek biologicznych, takich jak osocze krwi. Testy te wykorzystuj generatory rónych wolnych rodni-ków (zwykle s to termolabilne zwizki diazowe, generujce rodniki peroksylowe) i utlenianie analizowanych próbek. Próbka dodana do mieszaniny reakcyjnej opónia współdziałanie pomi-dzy detektorem a wolnym rodnikiem. Wyniki pomiarów oznaczane s na podstawie opónienia zajcia reakcji detektor-rodnik, w czasie którego zuywane s antyoksydanty zawarte w analizo-wanym materiale. Istotne jest, aby stała szybkoci reakcji utleniania próbki była duo wiksza ni stała szybkoci utleniania zwizku uywanego jako detektor. Metody opisane w literaturze opieraj si na wygenerowaniu rodników peroksylowych i pomiarze kinetyki fluorescencji lub chemiluminescen-cji produktu ich reakcji z tzw. detektorem, zwizkiem łatwym do wykrycia. Zwykle jako detektor stosuje si pochodne fluoresceiny w pomiarach fluorescencyjnych, a luminol w pomiarach chemiluminescencyj-nych [Wang i Joseph 1999]. Opisano take zastosowanie metody fotometrycznej do oznaczania potencja-łu antyoksydacyjnego w komórkach [Valkonem i Kuusi 1999].  Celem bada	 było sprawdzenie moliwoci zastosowania metody fluorymetrycznej do osza-cowania potencjału antyoksydacyjnego w stosunku do wygenerowanych rodników peroksylowych, hydroksylowych i nadtlenoazotynów. Metod testowano na grupie naturalnych antyoksydantów. MATERIAŁ  Odczynniki: dioctan 2,7-dichlorofluorescyny (DCFH-DA) 2,2’-diazobis (2-amidinopropan) dichlorowodorek (AAPH – generator rodników perksylowych), chlorowodorek 3-morfolino-sydnoniminu (SIN-1 – generator nadtlenoazotynów) oraz bufor fosforanowy w tabletkach (pho-sphate buffered saline, PBS) zakupiono w firmie Sigma (St. Louis, MO, USA). Pozostałe odczyn-niki były klasy cz.d.a. i stosowano je bez dalszego oczyszczania. Wod Milli-Q (Millipore, Bed-ford, USA) uywano do przygotowania wszystkich roztworów.  Do bada	 wykorzystano take zielon herbat, aroni i imbir. Napoje alkoholowe stosowane w pomiarach (Wódka ołdkowa Gorzka – Polmos, Lublin, Polska; Bols Vodka – Bols Royal Distillers, Amsterdam, Holandia; Unicum Herb Liqueur – Zwack Unicum Co. Ltd., Wgry; Sal-miaki Cosken Corva – Altia Oyj, Helsinki, Finlandia; Metaxa – S.E.A. Metaxa, A.B.E. Grecja; Whisky Johnnie Walker – Red Label, Szkocja) zakupione zostały w pobliskim supermarkiecie.  Aparatura: produkt utleniania DCFH mierzono przy uyciu czytnika fluorescencji z płytek (Thermo Labsystems, Finland); pomiary wykonywano w temperaturze pokojowej, zastosowano długoci fali wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 538 nm; poziom fluorescencji mierzono co minut. METODA W przeprowadzonych badaniach uywano jako detektora dioctan 2,7-dichlorofluorescyny (DCFH-DA), która pod wpływem esteraz komórkowych ulega przekształceniu do dichlorofluore-scyny (DCFH). Ostatecznie, po reakcji z rodnikiem peroksylowym, otrzymuje si dichlorofluore-scein (DCF), która charakteryzuje si maksimum adsorpcji przy 520 nm.  Pomiary całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA) w stosunku do rodników peroksy-lowych oparto na zmodyfikowanej procedurze Valkonena i Kuusi [1997], w której rodniki perok-sylowe generowane s metod rozkładu termicznego AAPH (ko	cowe stenie – 56 mM). ZASTOSOWANIE METODY FLUORYMETRYCZNEJ DO OSZACOWANIA...   57 W pierwszym etapie reakcji pojawiaj si dwa rodniki wglowe, które nastpnie szybko reaguj z czsteczkami tlenu, dajc rodniki peroksylowe. Ich stenie mierzono poprzez konwersj diocta-nu dichlorodihydrofluorescyny (DCFH-DA) do silnie fluoryzujcej dichlorofluoresceiny (DCF). Reakcj przeprowadzano w 50 mM roztworze PBS w 24°C. DCFH-DA rozpuszczano w DMSO, a nastpnie dwukrotnie rozcie	czano wod do ko	cowego stenia 14 µM.  Rodniki hydroksylowe były generowane w reakcji Fentona. 0,5 mM Fe2+ i 2 mM H2O2 inku-bowano w 5 mM buforze fosforanowym (pH 7,4) w obecnoci 1 mM pHBA w 37°C. SIN-1, donor nadtlenoazotynów (ko	cowe stenie 200 µM) został wykorzystany do generowania tlenku azotu (NO). SIN-1 spontanicznie hydrolizuje w fizjologicznym pH do tlenku azotu NO i anionorodnika ponadtlenkowego O2-. Anion ten nie wpływa na fluorescencj DCF (1). Tlenek azotu, jak i wytwo-rzony z nich nadtlenoazotyn utleniaj DCFH, co zwiksza fluorescencj (3). Analizowana próbka przesuwa mierzone sigmoidalne krzywe kinetyczne. Mierzono czas, po jakim warto fluorescen-cji wzrastała o zadan warto (w naszym przypadku wynosiła ona w jednostkach wzgldnych 0,2). Wielko ta, definiowana jako CPA, zalena jest od sumy iloczynów stenia wszystkich antyoksydantów w próbce i ich stałych szybkoci reakcji.  Pomiary powtarzano 3-krotnie dla kadej próbki. Wyniki uredniono i wyraono wzgldem redniej wartoci uzyskanej dla próbki kontrolnej. Wyjciowe roztwory ekstraktów analizowanych ziół przygotowano w steniu 10 mg/ml, za roztwory alkoholi w steniu 10 µl/ml. Roztwory przygotowano w wodzie Milli-Q. Procedura dowiadczalna została oparta na metodzie, w której produkty reakcji wygenerowa-nych wczeniej rodników peroksylowych z DCFH były mierzone fluorometrycznie. Nie uywano esterazy, DCFH-DA rozpuszczano w DMSO (50% ko	cowej objtoci). Sigmoidalne krzywe kinetyczne uzyskane dla badanych próbek były przesunite wzgldem krzywych uzyskanych dla próbek niezawierajcych antyoksydantów. Dla kadej krzywej okrelono czas, po którym kine-tyczna krzywa fluorescencyjna przyrasta o 0,2 swojej wartoci pocztkowej. Rónice midzy wyznaczonymi z krzywych czasami dla próbki z antyoksydantem i bez niego były miar całkowi-tego potencjału antyoksydacyjnego CPA.  WYNIKI  I  DYSKUSJA W ostatnim czasie obserwuje si wzrost zainteresowania naturalnymi antyoksydan-tami, wród nich zwłaszcza barwnikami rolinnymi – flawonoidami i antocyjanami. Przykładem moe tu by antocyjan C3G (3-O--D glikozyd cyjanidyny) i jego aglikol – cyjanidyna. Zwizki te, obecne w wielu herbatach i ziołach, s silnymi antyoksydantami [Tsuda i in. 2000]. Szczególnie due ich iloci znajduj si w aronii (Aronia melanocar-pa). Cyto- i neuroprotekcyjne właciwoci tych zwizków s szeroko opisywane w litera-turze. Szczególnie bogatym we flawonoidy ziołem jest herbata. Jej prozdrowotne wła-ciwoci s znane ju od czterech tysicy lat. Wartoci CPA 1 mg/ml ekstraktów ziół, odniesione do rodników hydroksylowego i peroksylowego oraz nadtlenoazotynu, przedstawiono na rys. 1. W przeprowadzonych badaniach stwierdzono, e najsilniejszymi własnociami antyoksydacyjnymi ze wszyst-kich badanych substancji charakteryzowała si zielona herbata (przy czym były one naj-słabsze w stosunku do rodnika hydroksylowego). Wartoci CPA mocnych alkoholi obj-tych badaniem przedstawiono na rys. 2. Stwierdzono, e najsilniejszym antyoksydantem wród alkoholi był wgierski Unicum. Ponadto potwierdzono spostrzeenie, e wzgldne wartoci CPA zale od generowanego rodnika, co oznacza, e zawsze powinny by one odniesione do rodnika, którego dotycz wykonywane  pomiary.  C.  KOWALSKI, M. POMORSKA, B.K. GŁÓD, A.  KONIOR  58  Ziel. Herb Aronia ImbirRO2OHONOO020406080100120140160CPA [min] RO2 OH ONOO  Rys. 1. Wartoci CPA 1 mg/ml ekstraktów ziół, odniesione do rodników hydroksylowego  i peroksylowego oraz nadtlenoazotynu UnicumSalmiakiMetaxaWhiskyołdkowaKrupnikBolsAbsynt020406080100120140160CPA [min]RO2 OH ONOO Rys. 2. Wartoci CPA badanych alkoholi Fig. 2. TAP values of the examined alcohols    Ziel. herb. Fig. 1. TAP values of 1mg/ml of herb extracts related to peroxyl and hydroxyl radicals  and peroxynitrite ZASTOSOWANIE METODY FLUORYMETRYCZNEJ DO OSZACOWANIA...   59 Zgodnie z wyprowadzonym równaniem CPA, odniesionym do rodnika peroksylowe-go, powinno si ono charakteryzowa liniow krzyw kalibracji, co zostało potwierdzone w badaniach. Liniowa krzywa kalibracji umoliwia łatwe porównywanie wyników ró-nych próbek. Krzywe kalibracyjne odniesione do rodnika hydroksylowego i nadtlenoazo-tynu nie wykazywały zalenoci liniowej, w tych przypadkach otrzymano zalenoci wykładnicz i logarytmiczn.  PIMIENNICTWO Bass D.A., Parce J.W., Dechatelet L.R., Szejda P., Seeds M.C., Thomas M. 1983. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrofils: a graded response to membrane stimula-tion. J. Immunol. 130, 1910–1917. Buhmann C., Arlt S., Kontush A., Moller-Bertram T., Sperber S. 2004. Plasma and CSF markers of oxidative stress are increased in Parkinson’s disease and influenced by antiparkinsonian medication. Neurobiol. Disease 15, 160–170. Gabriel C., Camnis A., Sureda F.X., Aquirre L., Escubedo E., Pallas M., Comarasa J. 1997. De-termination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diaceta-te and flow cytometry. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 38, 93-98. Ghiselli A., Serafini M., Nautella F., Scaccini C. 2000. Total antioxidant capacity as a tool to assess redox status: critical view and experimental data. Free Rad. Biol. Med. 29, 1106–1114. Głód B.K., Czapski G.A., Haddad P. 2000. Application of high-performance liquid chromatogra-phy to the of free radical reactions in biological systems. Trends Anal. Chem. 19, 492–449. Halliwell B. 1994. Free radicals, antioxidants and human diseases: Curiosity, cause, or consequen-ce? Lancet 344, 721–724. Halliwell B. 2000. The antioxidant paradox. Lancet 355, 1179–1180. Malinka W., Kaczmarz M., Filipek B., Sapa J., Głód B. 2002. Preparation of novel derivatives of pyridothiazine-1,1-dioxide and thair CNS and antioxidant properties. Farmaco. 57, 737–746.  Tsuda T., Horio F., Osawa T. 2000. The role of anthocyanins as an antioxidant under oxidative stress in rats. BioFactors. 13, 133–139. Valkonen M., Kuusi T. 1997. Spectrophotometric assay for total peroxyl radical-trapping antioxi-dant potential in human serum. J. Lipid Res. 38, 823–833. Wang H., Joseph J.A. 1999. Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader. Free Rad. Biol. Med. 27, 612–616. SUMMARY Total Antioxidant Potential (TAP) frequently better describes the antioxidant properties of the complex biological samples (such as herbal extracts or blood plasma) than concentrations of all individual antioxidants in the sample. In the paper improved fluorometric assays of the TAP measurements have been described. These tests adopt thermolabile diazocompound [2,2’-diazobis (2-amidinopropane) dihydrochloride – AAPH] generating peroxyl radical, Fenton reaction pro-duced hydroxyl radicals and SIN-1 (3-morpholino-sydnonimine) generating peroxynitrite. These radicals oxidize the analyzed samples and so called „detector”. Sample competes with the reaction be-tween detector and radical; therefore, it delays this reaction. Results are calculated from the delay time during which antioxidants are consumed. Assays related to different radicals are described and compared. They will be tested measuring antioxidant potentials of different herb extracts and alcohol compounds.  Key words: free radicals, antioxidant, Total Antioxidant Potential, fluorometry 

Zastosowanie metody fluorymetrycznej do oszacowania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego

https://czasopisma.up.lublin.pl/mv/article/download/3565/2432

Zastosowanie metody fluorymetrycznej do oszacowania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Czasopisma Uniwersytetu Przyrodniczy w Lublinie