Albrizio, Maria

Guaricci, Ac

Micera, E

Zarrilli, A.

ALBRIZIO, MARIA

GUARICCI AC

MICERA E

ZARRILLI A.

Archivio istituzionale della ricerca - Università di Bari

CANALI DEL CALCIO VOLTAGGIO DIPENDENTI DI TIPO L NELLE CELLULE DELLA GRANULOSA MURALE EQUINA  L-TYPE VOLTAGE-GATED CA2+ CHANNELS IN EQUINE MURAL GRANULOSA CELLS  Albrizio M, Guaricci AC, Micera E, Zarrilli A Dipartimento di Produzione Animale, Bari  Parole chiave: equino, cellule granulosa, canali del Ca2+ di tipo L Key words: equine, granulosa cells, L-type Ca2+ channels  SUMMARY – In this study the expression of L-type voltage-gated Ca2+ channels in equine granulosa cells was investigated by molecular techniques. During the breeding season, mural granulosa cells (GC) were recovered from small, medium and large follicles. Protein were extracted from GC and hybridized to a primary antibody anti a1c subunit of L-type calcium channel. Results show that GC cells express L-type calcium channels and that the expression level differs in  follicle of different diameter.  INTRODUZIONE – Le cellule della granulosa murale circondano l’ovocita e ne promuovono la maturazione secernendo ormoni e fattori di crescita paracrini in risposta agli stimoli gonadotropi (1). Il Ca2+ è uno ione chiave dei processi steroidogenetici; studi condotti sulle cellule della granulosa di numerose specie animali hanno dimostrato che la presenza dello ione nel mezzo extracellulare è indispensabile per la biosintesi ormonale (2,3,4). I canali del calcio voltaggio dipendenti rivestono un ruolo di primo piano nella modulazione di numerosi processi cellulari dipendenti dallo ione  calcio quali l’apoptosi (5), l’organizzazione del citoscheletro (6), la proliferazione cellulare, sia in condizioni fisiologiche quali l’ovulazione e la formazione del corpo luteo, che in condizioni patologiche come la formazione di cisti ovariche (7). Le variazioni intracellulari delle concentrazioni di calcio condizionano fortemente la fisiologia ovarica (8,9), malgrado ciò gli studi sulla caratterizzazione funzionale e molecolare dei canali del calcio voltaggio dipendenti delle cellule della granulosa sono ad oggi ancora del tutto preliminari. I primi approcci molecolari e funzionali sono stati condotti sulle cellule della granulosa murale umana (10) e murina (11), mentre nelle specie animali di interesse zootecnico sono stati condotti esclusivamente studi di tipo funzionale (12,13) In questo lavoro è stata analizzata l’espressione dei canali del calcio voltaggio dipendenti di tipo L nelle cellule della granulosa follicolare equina mediante western blot.   MATERIALI E METODI – L’analisi è stata condotta durante la stagione riproduttiva su tre soggetti adulti, macellati al locale mattatoio. Immediatamente dopo il prelievo, le ovaie sono state poste in soluzione salina e trasportate in laboratorio entro un’ora. La granulosa murale è stata recuperata mediante scraping dei follicoli.  Sono stati ottenuti pool di cellule di granulosa recuperate rispettivamente da follicoli piccoli (<0,5 cm), follicoli medi (0,5-2,5cm) e  follicoli grandi (>2,5cm) di diametro. Le cellule, dopo lavaggio in PBS, sono state congelate in azoto liquido,  polverizzate meccanicamente e incubate per 30’ a 4°C in PBS/0.1% Triton in presenza di un cocktail di inibitori di proteasi (Roche, Milano). Dopo centrifugazione a 10000xg a 4°C, è stato prelevato il sovranante contente l’estratto proteico che è stato dosato allo spettrofotometro (Beckman DU 640).  Le proteine (30µg/campione) sono state separate mediante SDS–page su gel precostituito al 12% (BioRad, Milano), trasferite su membrana immobilon-P (Millipore, Bedford MA, USA) e ibridate per 18 ore con anticorpo primario di coniglio anti subunità a1c del canale del calcio voltaggio dipendente di tipo L purificato per affinità (Sigma, Milano) diluito 1:1000. L’immunocomplesso è stato rivelato mediante chemiluminescenza (SuperSignal West Pico,  Pierce, Milano)  RISULTATI – L’analisi condotta mediante western blot ha rivelato la presenza, nei campioni di granulosa recuperata da follicoli medi e piccoli, di una banda di ibridazione di ~ 190 kDa corrispondente alla forma di basso peso molecolare attesa (14). La granulosa recuperata da follicoli di dimensioni superiori a 2,5 cm non ha dato alcun segnale di ibridazione. Come si può osservare in figura, proteine estratte da cervello di ariete (controllo positivo), mostrano invece un segnale di ibridazione di ~ 210 kDa, verosimilmente corrispondente alla forma attesa ad alto peso molecolare (14). I livelli di espressione dei canali del calcio di tipo L, nei campioni di granulosa, risultano dipendenti dalle dimensioni dei follicoli, apparendo massimamente espressi nei follicoli piccoli, poco espressi nei follicoli medi, mentre non paiono essere espressi in quelli grandi.          Immunoblotting.  Proteine estratte da cellule della granulosa murale equina provenienti da follicoli grandi (Gfg), follicoli medi (Gfm) e follicoli piccoli (Gfp) e proteine estratte da cervello di ariete (CA) come controllo positivo, sono state separate mediante SDS-page, trasferite su membrana e ibridate con anticorpo primario anti-subunità a1cdei canali del calcio voltaggio dipendenti di tipo L. Le frecce indicano le dimensioni dei frammenti di ibridazione ottenuti.  DISCUSSIONE – Gli ioni calcio giocano un ruolo di primo piano nella fisiologia delle cellule agendo come secondi messaggeri intracellulari in grado di regolare o avviare eventi biochimici ed elettrici. Una varietà di canali voltaggio dipendenti  regola la distribuzione e la funzionalità degli ioni calcio nelle cellule eccitabili. Tra le cellule endocrine anche quelle della granulosa esibiscono attività elettrica la cui modulazione può regolarne la funzione, consentendo di inviare segnali all’ovocita per indurlo alla ripresa della meiosi (15). I risultati di un precedente lavoro (12), in cui venivano analizzate le variazioni delle concentrazioni intracellulari dello ione calcio in risposta a specifici agonisti/antagonisti dei canali del calcio voltaggio dipendenti di tipo L, hanno evidenziato la presenza di tali canali in cellule della granulosa recuperate da follicoli di piccole e medie dimensioni. Il presente studio attraverso l’analisi dell’espressione della subunità a che rappresenta la maggiore unità funzionale del canale, poiché costituisce il sito di permeazione dello ione, non solo conferma l’esistenza dei suddetti canali nelle cellule della granulosa follicolare equina, ma consente anche una preliminare analisi qualitativa dei livelli di espressione della suddetta subunità durante la fase di accrescimento follicolare. La presenza inoltre della banda di ibridazione a basso peso molecolare pone le basi per uno studio successivo inteso a chiarire se tale forma rappresenti una prerogativa di specie o se piuttosto sia tessuto specifica.   BIBLIOGRAFIA – 1) Nilsson E, Skinner MK (2001) J Soc Gynecol Invest, 8, S17-S20. 2) Veldhuis JD et al (1984) Endocrinology, 14, 441-449. 3) Tsang BK, Carnegie JA (1983) Endocrinology, 113, 763-769. 4) Asem EK, Hertelendy F (1986) Gen Comp Endocrinol, 62, 120-128. 5) Musiche S, et al (2000) Ann NY Acad Sci, 926, 101-115. 6) Batten BE, Anderson E (1981) Am J Anat, 161, 101-114. 7) Fritz S et al (1999) J Clin Endocrinol Metab, 84, 1744-1750. 8) Platano D et al (2005) J Clin Endocrinol & Metab, 90, 2192-2197.  9) Gioia L et al (2004) SISVET, LVIII,26-27. 10) Agoston A et al (2004) J Clin Endocrinol & Metab, 89, 4503-4512. 11) Cottom J et al (2003) J Biol Chem, 781, 7167-7179. 12) Micera E et al (2005) SISVET, LVIX, 35-36. 13) Asem EK et al (2002) Am J Physiol Endocrinol Metab, 282, E184-E196. 14) Hell JW et al (1993) J Cell Biol, 123, 949-962. 15) Mattioli M, Barboni B (2000) Mol Cell Endocr, 161, 19-23.  Ricerca eseguita con contributo Fondi d’Ateneo 2005    210 kDa190 kDaCAGfpGfmGfg

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Canali del calcio voltaggio dipendenti di tipo L nelle cellule della granulosa equina

Canali del calcio voltaggio dipendenti di tipo L nelle cellule della granulosa equina

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