Studio di linkage in famiglie di pazienti affetti da Iperinsulinismo Congenito dell'Infanzia (CHI) mediante tecnologie di
genotipizzazione ad alta risoluzione di SNP
L' Iperinsulinismo Congenito dell'Infanzia (CHI, MIM # 256450) \ue8 una patologia grave caratterizzata da una inappropriata
secrezione di insulina da parte delle beta-cellule pancreatiche, che causa severa ipoglicemia spesso pericolosa per la stessa vita del
paziente. La patologia si presenta eterogenea dal punto di vista clinico, genetico, morfologico e funzionale e comporta un'estrema
variabilit\ue0 nell'et\ue0 dell'esordio della malattia, nella severit\ue0 con cui si manifesta e nella risposta alle cure mediche; \ue8 una delle
principali cause di danni neurologici e diabete iatrogeno (Aynsley-Green 2000; Cosgrove 2004; Dunne 2005). Nei pazienti affetti da
CHI sono state evidenziate mutazioni in differenti geni, ed \ue8 stata dimostrata un' ereditariet\ue0 di tipo sia autosomico recessivo che
dominante (de Lonlay 2005; Henwood 2004). Circa il 50% casi sono causati da mutazioni sui geni ABCC8 (MIM # 600509) e
KCNJ11 (MIM # 600937) che codificano per entrambe le subunit\ue0 (KIR6.2 e SUR1) costituenti il canale del potassio ATP
dipendente nelle beta--cellule (KATP). Circa il 5% dei pazienti affetti da CHI ha mutazioni dominanti nel gene che codifica per la
glutammatodeidrogenasi (GDH) (Stanley 1998). Sono noti anche rari casi di CHI causata da mutazioni attivanti sul gene della
glucokinasi (GCK) (Glaser 1998). Recentemente sono state trovate mutazioni nel gene dell'idrossi-L-3-acildeidrogenasi a catena
corta (SCHAD) (Clayton 2001). E' stata anche descritta, in pochi pazienti, una sindrome singolare di ipoglicemia, conseguente
all'esercizio fisico, la cui eziologia genetica rimane sconosciuta (Meissner 2001). Dal punto di vista istopatologico sono state
distinte due diverse forme: si pu\uf2 avere un coinvolgimento diffuso delle beta-cellule nel pancreas (forma diffusa, Di-HI), o
un'iperplasia adenomatosa focale (forma focale, Fo-HI), dove regioni distinte del pancreas appaiono essere coinvolte, mentre le
aree circostanti sono istologicamente e funzionalmente normali. La forma diffusa della malattia \ue8 causata da mutazioni germinali e
interessa l'intero corpo del pancreas (Goossens 1989). La forma focale invece \ue8 causata dalla perdita di una porzione del
cromosoma materno (11p15) associata a mutazioni ereditate dall'allele paterno (Verkarre 1998).
In questo panorama comunque, per circa il 50% dei pazienti affetti, non \ue8 stata ancora determinata un'eziologia genica precisa,
suggerendo cos\uec l'ipotesi che altri geni ad oggi sconosciuti possano essere coinvolti. Sono stati proposti molti geni quali candidati
(Sund 2001; Molven 2002; Ashcroft 2005) ad esempio fattori di trascrizione che regolano lo sviluppo del pancreas, molti dei quali
regolano anche la trascrizione di geni codificanti ormoni, oppure enzimi o recettori che intervengono nell' omeostasi del glucosio
(Molven 2002).
Vista la lunga lista di geni candidati i Polimorfismi a Singolo Nucleotide (SNPs) costituiscono dei marcatori validi per evidenziare
nuovi loci genici nelle famiglie di pazienti con CHI, negativi per mutazioni, e quindi contribuire a comprendere il ruolo dei canali
KATP dipendenti sull'eziologia di patologie che coinvolgano la funzionalit\ue0 delle beta cellule (Ashcroft 2006). Gli SNPs rappresentano variazioni del genoma generate dalla mutazione di una singola base nel DNA e costituiscono la fonte pi\uf9 semplice e comune del polimorfismo genico nel genoma umano. Gli SNPs sono circa il 90% di tutti i polimorfismi del DNA e il singolo nucleotide alterato pu\uf2 essere compreso sia nelle regioni codificanti che in quelle non codificanti. La frequenza degli SNPs \ue8 di uno ogni 100-300 basi distribuite lungo i 3 miliardi di basiche costituiscono il genoma umano (The International HapMap Consortium 2005). Molti SNPs non influenzano la biologia o le funzioni fisiologiche dell'ospite, tuttavia i ricercatori ritengono che alcuni SNP favoriscano la predisposizione alla malattia o influenzino la risposta a farmaci ed altre terapie (Ventre 2001). L'avanzamento senza precedenti nella mappatura degli SNPs del genoma umano ha avuto un effetto notevole sul progresso della ricerca delle malattie genetiche. Le mappature degli SNPs stanno contribuendo ad identificare migliaia di marcatori lungo tutto il genoma facilitando l'analisi di mappe pi\uf9 grandi generate dai ricercatori nel Progetto Genoma che con la ditta "Celera Genetics" ha fornito, nel 2000, la descrizione completa del genoma umano (Ventre 2001; Goddard 2002). Da un punto di vista analitico, la possibilit\ue0 di identificare marcatori multipli implica la necessit\ue0 di applicare metodi statistici avanzati e strumenti bioinformatici applicati alla genetica molecolare per l'identificazione di correlazioni tra aplotipi e fenotipi in gruppi familiari. I test statistici multivariati, opportunamente corretti per limitare l'effetto delle comparazioni multiple sulle soglie di confidenza, possono essere applicati per individuare marcatori specifici e associazioni tra l' aplotipo di un locus e i geni che influenzano il fenotipo patologico (Di 2005; Liu 2003; Freimer 2005).
Dai dati della letteratura si evince che l'analisi di SNPs ha contribuito ad identificare i geni multipli connessi con malattie complesse (Meaburn 2006; Carlson 2004) quali la malattia di Alzheimer (Strittmatter 1996), il diabete di tipo 2 (Altshuler 2000), il diabete di tipo I (Florez 2003) ed altre malattie autoimmuni (Ueda 2003). Queste associazioni sono difficili da rivelare con i metodi convenzionali di "gene-hunting" perch\ue9 un singolo gene alterato pu\uf2 dare soltanto un piccolo contributo alla genesi della malattia. Parallelamente all'utilizzo degli SNPs per studi di associazione in malattie poligeniche si \ue8 pensato che questi marcatori potessero essere altrettanto validi se impiegati per l'analisi di linkage in malattie monogeniche (Matise 2000; Wilson 2000; Shepard 2000; Sellick 2004). Pochi studi fino ad ora hanno utilizzato l'analisi di SNPs per studi di linkage in patologie genetiche con trasmissione di tipo mendeliano, anche se molti studi supportano l'ipotesi che un set di SNPs ad alta densit\ue0 possa fornire un numero di informazioni equiparabile a quelle ottenute con screening genomici che utilizzano altri marcatori quali microsatelliti o
short-tandem-repeat polymorphisms (STRPs) (Wilson 2000; Matise 2003; Shepard 2004; Sellick 2004). Negli ultimi due anni tuttavia sono comparsi in letteratura studi che hanno utilizzato piattaforme ad alta densit\ue0 di SNPs per individuare nuovi geni coinvolti in malatie autosomiche, sia dominanti che recessive, quali diabete neonatale, craniosinostosi, displasia renale (Sellick 2004), leucodistrofia di Pelizaeus-Merzbacher (Uhlenberg 2004), Congenital vertical Talus e Charcot-Marie Tooth (Shrimpton 2004) e microcefalia primaria (Shen 2005). Il sequenziamento dei geni candidati evidenziati con l'analisi di linkage ha permesso di riscontrare nei casi descritti la presenza di mutazioni puntiformi.
In questo contesto di analisi genomiche si sono sviluppate negli ultimi anni numerose piattaforme (Affymetrix, Applied Biosystems, Illumina) per l'analisi simultanea di migliaia di SNPs, attraverso le quali \ue9 possibile identificare loci genici interessanti, associati a patologie a caratteri complessi (Butcher 2004). In particolare con i 2 Array che costituiscono il GeneChip Human Mapping 100K Set della ditta Affymetrix si possono analizzare contemporaneamente pi\uf9 di 100000 SNPs con un intervallo medio tra i vari marcatori di 23.6 Kb (Meaburn 2006; Matsuzaki 2004).
Sulla base di queste considerazioni intendiamo utilizzare la piattaforma Affymetrix per lo studio della variabilit\ue0 genetica e studio di linkage in famiglie di pazienti affetti da Iperinsulinismo Congenito dell'Infanzi
