in un recente lavoro Valjent e collaboratori (Valjent E. et al. 2001 Eur. J. Neurosci. 14, 342-352) hanno dimostrato che la somministrazione di THC nel topo induce una transiente attivazione di ERK localizzata nello striato dorsale e nel nucleo accumbens. Tale effetto \ue8 strettamente dipendente dall\u2019attivazione del recettore CB1 come evidenziato dalla sua sensibilit\ue0 all\u2019antagonista selettivo SR141716A. Inoltre il THC induce la fosforilazione del fattore di trascrizione Elk-1, il quale rappresenta il maggior target nucleare di ERK e tale effetto risulta bloccato dalla somministrazione in vivo del composto SL327, un inibitore specifico delle MAPK/ERK kinasi. Queste prime evidenze sperimentali suggeriscono un ruolo importante per la via di MAP/ERK kinasi nella mediazione degli effetti dei cannabinoidi, ma nulla al momento \ue8 conosciuto sul ruolo di tale cammino nei processi di esposizione a lungo termine alla droga.
Scopo principale del progetto della presente unit\ue0 operativa \ue8 quello di indagare il ruolo della via Ras-ERK kinasi nei fenomeni di tolleranza, dipendenza fisica e sensitizzazione ai cannabinoidi.
La possibilit\ue0 di eseguire studi su topi geneticamente modificati nella loro capacit\ue0 di attivare la via ras-ERK fornitici dall\u2019unit\ue0 coordinata dalla Prof.ssa Zippel, rappresenta un valido strumento per definire l\u2019importanza di tale cammino intracellulare. In particolare ci avvarremo di topi knock out per il gene ras-GRF1 che codifica per lo scambiatore deputato all\u2019attivazione delle proteine ras che a loro volta rappresentano l\u2019interruttore molecolare che porta all\u2019attivazione sequenziale dei membri appartenenti alla cascata della via MAP/ERK kinasi. Tale scambiatore \ue8 specificatamente attivato dai recettori accoppiati a G proteine a cui il recettore cannabico CB1 appartiene.
Pi\uf9 dettagliatamente, il lavoro della presente unit\ue0 operativa sar\ue0 cos\uec sviluppato:
1) analisi dell\u2019effetto della somministrazione di dosi crescenti di THC e/o di CP-55,940 per via sottocutanea in topi ras-GRF1 knock out e wild type mediante valutazione di due classici effetti cannabici, quali l\u2019analgesia e la riduzione dell\u2019attivit\ue0 locomotoria, testati rispettivamente mediante il test del tail flick e l\u2019uso di una gabbia di attivit\ue0 locomotoria.
2) Studio della cinetica dello sviluppo della tolleranza agli effetti analgesici e di riduzione dell\u2019attivit\ue0 locomotoria dopo somministrazione ripetuta di THC e/o CP-55,940 in topi wild type e knock out.
3) valutazione della sindrome astinenziale precipitata mediante somministrazione dell\u2019antagonista del recettore cannabico centrale CB1 SR141716 in topi knock out e wild type trattati cronicamente con THC e/o CP-55,940. A tale scopo verr\ue0 utilizzato un protocollo di analisi comportamentale precedentemente messo a punto per la sindrome astinenziale da cannabinoidi (Aceto et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 278, 1290-1295, 1996).
4) valutazione della presenza del fenomeno della sensitizzazione comportamentale al THC e/o al CP-55,940 in topi knock out e wild type. A tale scopo topi trattati cronicamente con i cannabinoidi verranno riesposti ad una dose soglia di THC e/o CP-55,940 dopo un lungo intervallo di sospensione dalla droga stessa e sottoposti ad analisi comportamentale verificando la presenza di comportamenti specifici della sensitizzazione da cannabinoidi (stereotipie, attivit\ue0 esplorativa).
5) studio in topi wild type dell\u2019effetto della somministrazione in vivo di SL327, inibitore selettivo di MAPK/ERK kinasi sullo sviluppo delle sopracitate risposte acute e croniche ai cannabinoidi.
6) valutazione dell\u2019attivazione dei pi\uf9 comuni fattori di trascrizione correlati alla fosforilazione di ERK e/o attivati dal signalling del recettore cannabico nelle diverse aree cerebrali di topi knock out e wild type dopo trattamento acuto e cronico. In particolare i cervelli verranno rapidamente prelevati dagli animali trattati e le aree cerebrali dissezionate seguendo le coordinate stereotassiche dell\u2019atlante di Franklin and Paxinos ("The mouse brain in stereotaxic coordinates", New York, Academic Press,1996)al fine di preparare estratti nucleari in cui valutare l\u2019attivit\ue0 di fattori di trascrizione quali cfos, fos B, c-jun, Elk-1 e CREB. A tale scopo verranno impiegati kit ELISA disponibili commercialmente che utilizzano specifici anticorpi diretti contro la forma fosforilata (attivata) di tali fattori e identificabili mediante anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) che permette una reazione colorimetrica facilmente quantificabile tramite l\u2019uso di uno spettrofotometr
