Identification and analysis of potential substrates and inhibitors of human protein subfamily 1C aldo-keto reductase (AKR1C) obtained by recombinant expression

Abstract

Истраживање има фокус на хуманим ензимима из суперфамилије алдо-кето редуктаза, које имају велики метаболички значај за хомеостатско функционисање организма. Неки од чланова подфамилије 1С алдо-кето редуктаза (AKR1C) имају улогу у развоју одређених патолошких стања, као што су леукемија, тумори простате, дојке и ендометријума, као и у смањивању ефекта хемотерапија. До сада није регистрован лек који директно утиче на протеине ове групе и самим тим је акценат на изналажењу специфичних лиганада (супстрата, инхибитора), који би могли да имају фармаколошку примену, али и на утврђивању везе између структуре и функције испитиваних лиганада према ензиму. Теза је имала фокус на протеину AKR1C3. У овој дисертацији је представљена оптимизација ензимског есеја и испитивање потенцијалних лиганада и њиховог ефекта на ензимску активност одређених хуманих изоформи протеина из подфамилије AKR1C. Тестирана су синтетисанa стероиднa jeдињења, комерцијална једињења и биљни екстракти. Стероидни лиганди (AKR-1, -2, -3, -7, -9, -19 и -22) који су показали добре инхибиторне карактеристике су детаљније описани одређеним добијеним кинетичким параметрима и затим су кокристализовани са протеином и кофакторм. Од 7 различитих комплекса протеина са најбољиминхибитором, за два комплекса су добијене дифракције са инхибитором и решене кристалне структуре са лигандом у везном месту и врло добром резолуцијом, AKR-7: 1.7 Å, AKR -19: 1.6 Å. Ови резултати представљају прве протеинске кристале чију су структуру решили истраживачи из Србије, а у научном смислу и одличну основу за даљи дизајн и тестирање једињења и кокристализације.Istraživanje ima fokus na humanim enzimima iz superfamilije aldo-keto reduktaza, koje imaju veliki metabolički značaj za homeostatsko funkcionisanje organizma. Neki od članova podfamilije 1S aldo-keto reduktaza (AKR1C) imaju ulogu u razvoju određenih patoloških stanja, kao što su leukemija, tumori prostate, dojke i endometrijuma, kao i u smanjivanju efekta hemoterapija. Do sada nije registrovan lek koji direktno utiče na proteine ove grupe i samim tim je akcenat na iznalaženju specifičnih liganada (supstrata, inhibitora), koji bi mogli da imaju farmakološku primenu, ali i na utvrđivanju veze između strukture i funkcije ispitivanih liganada prema enzimu. Teza je imala fokus na proteinu AKR1C3. U ovoj disertaciji je predstavljena optimizacija enzimskog eseja i ispitivanje potencijalnih liganada i njihovog efekta na enzimsku aktivnost određenih humanih izoformi proteina iz podfamilije AKR1C. Testirana su sintetisana steroidna jedinjenja, komercijalna jedinjenja i biljni ekstrakti. Steroidni ligandi (AKR-1, -2, -3, -7, -9, -19 i -22) koji su pokazali dobre inhibitorne karakteristike su detaljnije opisani određenim dobijenim kinetičkim parametrima i zatim su kokristalizovani sa proteinom i kofaktorm. Od 7 različitih kompleksa proteina sa najboljiminhibitorom, za dva kompleksa su dobijene difrakcije sa inhibitorom i rešene kristalne strukture sa ligandom u veznom mestu i vrlo dobrom rezolucijom, AKR-7: 1.7 Å, AKR -19: 1.6 Å. Ovi rezultati predstavljaju prve proteinske kristale čiju su strukturu rešili istraživači iz Srbije, a u naučnom smislu i odličnu osnovu za dalji dizajn i testiranje jedinjenja i kokristalizacije.This research focuses on human enzymes of the aldo-keto reductase superfamily, whose functions have a significant metabolic impact on organism homeostasis. Some members of the 1C aldo-keto reductase (AKR1C) subfamily play role in the development of specific pathological conditions, such as leukaemia, prostate cancer, breast cancer and endometrial cancer, as well as reducing the effectivness of chemotherapy. However, currently there are no approved and registered drugs that directly affect proteins from this subfamily. Therefore our main aim was to screen for specific ligands (substrates, inhibitors) with potential pharmacological applications, and to establish structure-activity relationships for these ligands and enzymes. This thesis mainly focuses on isoform AKR1C3. In this dissertation, optimization of an enzymatic assay and testing of potential  ligands and their effects on the enzymatic activity of specific human isoforms of proteins from subfamily AKR1C are presented. Tested ligands include synthetic steroidal compounds, commercial compounds and plant extracts. Steroid compounds, AKR-1, -2, -3, -7, -9, -19 and -22, were found to be   good inhibitors of AKR1C3, and further kinetic studies were conducted. Finally, cocrystalization of protein AKR1C3 with cofactor and these inhibitors was accomplished. From 7 different complexes of protein with inhibitors, two structures were solved to very high resolution, AKR-7: 1.7 Å, AKR -19: 1.6 Å. These results represent the first protein crystal structures solved by researchers from Serbia, and  results provide an excellent basis for further design and testing of new inhibitors