Padronização da extração de DNA em tecidos de camundongos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) infectados experimentalmente com Angiostrongylus costaricensis

Abstract

Abdominal angiostrongyliasis is a zoonotic infection caused by Angiostrongylus costaricensis, a nematode with intravascular location in the mesentery. Humans become accidentally infected by ingesting food or water contaminated with third stage larvae present in mucus secreted by intermediate hosts, terrestrial mollusks. The confirmed diagnosis of human infection is made only through histopathology of biopsies or mesenteric tissues removed during surgical treatment. There are many cases in which the pathology is very suggestive however there is no evidence of parasite structures in the sections. Thus, the goal of this study was to standardize the extraction of DNA from formalin fixed paraffin embedded (FFPE) tissues from mice experimentally infected with Angiostrongylus costaricensis for DNA detection and future study of human angiostrongyliasis suspected cases. Materials and methods: 45 samples of each tissue of liver, lung, intestine and mesentery, totalizing 180 samples from 15 infected mice with A. costaricensis. Worms of Angiostrongylus cantonensis were separately embedded in paraffin as controls. From embedded tissues, histological sections of 3 μm were performed and stained with HE to confirm the presence of parasite structures under the microscope. Approximately 24 to 31 sections of 10 μm were used for DNA extraction. Worms were embedded in paraffin under different conditions such as fixative chemicals, time of fixation and types of paraffin. Specific DNA of Angiostrongylus was detected by Polymerase Chain Reaction (PCR) to amplify a sequence of 232bp, previously designed for detection in human serum assays. There was a positive amplification in 33 samples from liver, 12 from lung, 45 from mesentery and 36 from intestine wall. For different conditions of embedment, the amplification of the DNA with the buffered formalin fixative was more efficient compared to the unbuffered one; the time of fixation and the commercial brand of wax did not affect the detection of nucleic acids, however, the ratio of paraffin to tissue appears to influence the performance of the method since samples with residual paraffin no amplification was obtained. The 232bp segment also was not visualized in samples where there was no evidence of presence of parasite structures, suggesting that histopathology findings should guide the choice of the samples for DNA extraction, and those most likely to have parasite structures surrounding the lesion, even if degraded. The description of the performance of PCR in paraffin embedded tissues as a diagnostic tool in human abdominal angiostrongyliasis depends on the detailed evaluation criteria in histopathology and their association with a positive amplification of the specific probe.Angiostrongilíase abdominal é uma infecção zoonótica causada por Angiostrongylus costaricensis, um nematódeo com localização intravascular no mesentério. O homem se infecta acidentalmente ao ingerir alimentos ou água contaminados com larvas de terceiro estágio presentes no muco secretado por moluscos terrestres, hospedeiros intermediários. O diagnóstico confirmado da infecção humana é feito pelo exame histopatológico de biópsias ou segmentos ressecados durante o tratamento cirúrgico de casos complicados. Há muitos casos em que a histopatologia é muito sugestiva, porém sem evidenciarem-se estruturas do parasito nos cortes. Desse modo, o objetivo foi padronizar a extração de DNA em tecidos embebidos em parafina em modelo murino visando à detecção de ácidos nucléicos e posterior utilização no estudo de casos suspeitos a partir do exame histopatológico em humanos. Materiais e Métodos: 45 amostras de cada tecido de fígado, pulmão, mesentério e intestino, totalizando 180 amostras de 15 camundongos infectados com Angiostrongylus costaricensis; e vermes de Angiostrongylus cantonensis foram embebidos separadamente em parafina e nesses blocos contendo os tecidos foram realizados cortes histológicos de 3 μm para coloração por Hematoxilina-Eosina, e confirmado a presença de estruturas parasitárias, foram coletados de 24 a 31 cortes de 10 μm em um microtubo para a extração de DNA. Para a padronização do método, vermes foram embebidos em parafina em diferentes condições tais como o tipo de fixador, tempo de fixação e marcas comerciais de parafina. A partir dos cortes foram realizadas as extrações de DNA com o Kit Quiagen DNEasy tissue. Para a detecção de DNA específico de Angiostrongylus foi utilizado a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), para amplificação de uma sequência de 232pb, previamente desenhada para ensaios de detecção em soro humano. Em 33 amostras de fígado, 12 de pulmão, 45 de mesentério e 36 da parede intestinal houve amplificação do segmento de 232pb. Para as diferentes condições de emblocamento, as amplificações do DNA das amostras a partir do fixador formalina tamponada foram mais frequentes quando comparado com a formalina não tamponada; o tempo de fixação e o tipo de parafina não interferiram na detecção de ácidos nucléicos, entretanto, a quantidade de parafina no tecido parece influenciar no desempenho do método, pois nas amostras onde havia excesso de parafina não houve amplificação. O segmento de 232pb também não foi visualizado nas amostras onde não foi evidenciada a presença de estruturas parasitárias, sugerindo que a informação provinda da histopatologia deve orientar a retirada da amostra para extração de DNA, como aquelas de maior probabilidade de possuir estruturas parasitárias nas proximidades da lesão, mesmo que degradadas. A descrição do desempenho da PCR como recurso diagnóstico da infecção humana, em material embebido em parafina, depende da avaliação detalhada dos critérios de suspeita na histopatologia correlacionada com a frequência e reprodutibilidade do resultado da extração de DNA e sua amplificação