The present paper reports on a study in which we cloned the IL-1βgene of the gilthead seabream Sparus auratus Linnaeus, 1758, and produced the corresponding recombinant protein, in order to assess its usefulness as an immunostimulant and vaccine adjuvant in aquaculture.En el presente estudio se ha clonado el gen de la IL-1β de dorada Sparus auratus Linnaeus, 1758, y se ha producido la correspondiente proteína recombinante para evaluar su uso como inmunoestimulante y adyuvante en peces objeto de cultivo industrial.Instituto Español de Oceanografí

García-Castillo, J.

Meseguer, J.

Mulero, V.

Pelegrín, P.

Sepulcre, M.P.

Spanish

Pelegrín, P. (Pablo)

Sepulcre, M.P. (Maria Pilar)

Mulero, V. (Victoriano)

Meseguer, J. (José)

Repositorio Institucional Digital del IEO

Utilización de citoquinas recombinantes para la prevención de infecciones en piscicultura: ¿una realidad o una utopía?P. Pelegrín, J. García-Castillo, M. P. Sepulcre, V. Mulero y J. MeseguerDepartamento de Biología Celular. Facultad de Biología. Universidad de Murcia. Campus de Espinardo. E-30100 Murcia, España.Correo electrónico: meseguer@um.esRecibido en julio de 2001. Aceptado en febrero de 2002.RESUMENEn el presente estudio se ha clonado el gen de la IL-1 de dorada Sparus auratus Linnaeus,1758, y se ha producido la correspondiente proteína recombinante para evaluar su uso como in-munoestimulante y adyuvante en peces objeto de cultivo industrial.Palabras clave: Sparus auratus, inmunoestimulación.ABSTRACTUse of recombinant cytokines to prevent infectious diseases in aquaculture: Reality or fiction?The present paper reports on a study in which we cloned the IL-1gene of the gilthead seabream Sparusauratus Linnaeus, 1758, and produced the corresponding recombinant protein, in order to assess its use-fulness as an immunostimulant and vaccine adjuvant in aquaculture.Keywords: Sparus auratus, immunostimulation.189Bol. Inst. Esp. Oceanogr. 18 (1-4). 2002: 189-193 BOLETÍN. INSTITUTO ESPAÑOL DE OCEANOGRAFÍAISSN: 0074-0195© Instituto Español de Oceanografía, 2002INTRODUCCIÓNEl desarrollo de la acuicultura durante los últi-mos años ha fomentado el interés por el sistema in-munitario de los peces con el fin de poder estable-cer estrategias adecuadas que permitan controlarla aparición de enfermedades infecciosas. Para estefin, se han utilizado con éxito tanto la vacunacióncomo la inmunoestimulación. El gran desarrollo de la biología molecular enla última década ha supuesto un avance revolu-cionario en la mayoría de ramas científicas. Laacuicultura no se ha quedado al margen de estarevolución y, en la actualidad, son numerosos loslaboratorios que trabajan en diagnóstico molecu-lar de enfermedades infecciosas, diseño de vacu-nas de ADN, identificación de genes de resisten-cia a enfermedades, etc. En esta línea de trabajose encuadra el presente trabajo, que aborda la clo-nación molecular de una de las principales cito-quinas proinflamatorias, la interleuquina-1 (IL-1) de dorada Sparus auratus Linnaeus, 1758 y laproducción de la correspondiente proteína re-combinante para ser evaluada como inmunoesti-mulante o adyuvante de peces objeto de cultivoindustrial.MATERIAL Y MÉTODOSEl ARN total de macrófagos estimulados con 10µg/ml de lipopolisacáridos (LPS) se aisló con trizoly después fue retrotranscrito en cADN con un ce-bador oligo (dT)12-18. Los genes de la IL-1 fueronamplificados mediante reacción en cadena de lapolimerasa (PCR) utilizando pares de cebadoresespecíficos degenerados diseñados contra regionesconservadas de las IL-1 de otras especies. Los pro-ductos de PCR obtenidos se clonaron en el vectorpGEM-T-Easy y el ADN plasmídico de varios clonessecuenciados, en un secuenciador automático ABIautomated 377. Las secuencias obtenidas se utiliza-ron para diseñar cebadores específicos de los genescon el fin de amplificar los extremos 5’ y 3’ me-diante el sistema extremos de cADN de amplifica-ción rápida (RACE) (Rapid Amplification of cDNAEnds). Las proteínas recombinantes fueron produ-cidas en Escherichia coli (Migula, 1895) Castellani &Chalmers, 1919 usando el vector de expresión pET-15b y a continuación purificadas mediante croma-tografía de afinidad.RESULTADOSSe obtuvieron mediante transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) tresproductos solapados (figura 1) que contenían la se-cuencia completa del cADN de la IL-1 de dorada.El gen está formado por 1 271 nucleótidos, los cua-les incluyen una región traducible de 762 nucleóti-dos, una región 5’ no traducible (5’ UTR) de 102 nu-cleótidos y una 3’ UTR de 407 nucleótidos quecontiene 7 motivos de inestabilidad del ARN (ATT-TA), típicos de los genes de citoquinas inflamatorias.La secuencia también contiene una cola poli(A) de19 nucleótidos y una secuencia de poliadenilación si-tuada 14 residuos hacia arriba de la cola poli(A) (fi-gura 2). La región traducible cifra el precursor de laIL-1 de dorada, que sería una proteína de 253 ami-noácidos con un peso molecular aproximado de 29kDa, dos sitios potenciales de N-glicosilación y, comoel resto de secuencias de vertebrados inferiores, ca-rente del sitio de reconocimiento de la caspasa-1.La IL-1 de dorada muestra el mayor grado deidentidad de nucleótidos con las dos secuencias detrucha (60,5 % con el tipo 1 y 61,7 % con el tipo 2),así como en similitud de aminoácidos (67 % con eltipo 1 y 62 % con el tipo 2) (tabla I). Esta estrecharelación con las moléculas de trucha también se vereflejada en el árbol filogenético (figura 3), dondela secuencia de la IL-1 de dorada se encuentrajunto a las IL-1 de otros peces, y alejada de las demamíferos, anfibios y aves.Estudios de expresiónEl transcrito de la IL-1 fue detectado en todoslos tejidos de los peces infectados con Listonella an-P. Pelegrín et al. Citoquinas recombinantes y prevención de infecciones en pisciculturaBol. Inst. Esp. Oceanogr. 18 (1-4). 2002: 189-1931905’ 3’F3 F13 F1 F2R1 R2 R205 bp719 bp590 bpRegión no traducible de la IL-1β (509 bp)Marco abierto de lectura de la IL-1β (762 bp)3’ Cebador adaptador5’ Cebador adaptadorFigura 1. Posición de los cebadores F y Rutilizados para amplificar el gen de la IL-1de dorada y los productos obtenidos. (bp): pares de bases.Tabla I. Homología de la IL-1 de dorada con otras se-cuencias de IL-1 conocidas. Los valores en negrita son los de mayor homología.AminoácidosIdentidad deIdentidad Similitud nucleótidos (%) (%) (%)Especie humana 32 52 52,0Ratón 30 50 49,0Oveja 34 54 52,7Pollo 32 51 49,9Xenopus 32 50 48,1Trucha 1 53 67 60,5Trucha 2 47 62 61,7Carpa 32 53 49,0guillarum (Bergeman, 1909) MacDonell & Colwell,1986 (figura 4). La expresión es muy escasa en ce-rebro y alta en sangre y exudado peritoneal.Sorprendentemente se encontró también una ex-presión basal del transcrito de la IL-1 en muchosde los tejidos examinados de peces no infectados.Los estudios in vitro indican que el transcrito dela IL-1 es detectado en macrófagos purificadosdespués de sólo 20 ciclos de PCR, mientras perma-nece ausente en leucocitos totales de riñón cefáli-co. Este aumento en el transcrito de la IL-1 es par-ticularmente evidente después de estimular losmacrófagos con LPS y MAF (factor activador de losmacrófagos) (figura 5). Las amplificaciones de -actina confirman una cantidad similar de cADN departida en todas las muestras y que la reacción noestaba saturada a los 10 o 20 ciclos.P. Pelegrín et al. Citoquinas recombinantes y prevención de infecciones en pisciculturaBol. Inst. Esp. Oceanogr. 18 (1-4). 2002: 189-193 191Figura 2. Secuencia del cADN de la IL-1de dorada y de la correspondiente pro-teína deducida.20 PAMDoradaTrucha 1Trucha 2CarpaXenopusPolloOvejaRatónHombreFigura 3. Árbol filogenético que muestra la relación entre lasecuencia de aminoácidos de la IL-1 de dorada con otrassecuencias de IL-1 conocidas de distintos grupos de ani-males. El árbol ha sido construido por el método del vecinomás cercano con el programa CLUSTAL W. (PAM): porcentaje de mutación aceptada.DISCUSIÓNEn este estudio se muestra la secuencia comple-ta del cADN de la IL-1 de la dorada, pez teleósteomarino de gran interés en acuicultura. La molécu-la presenta un alto grado de homología con las tressecuencias de IL-1 conocidas de peces, especial-mente con los genes de trucha, tanto en los nucleó-tidos como en los aminoácidos. Las áreas de la mo-lécula con mayor grado de conservación son lasque forman la estructura secundaria de doce hojasbeta. En común con otras moléculas infamatorias,la IL-1 de dorada muestra varias copias del moti-vo ATTTA en su 3’ UTR, sugiriendo que la canti-dad de ARNm en la célula está delicadamente re-gulada.Las IL-1 de todos los mamíferos son sintetiza-das como un precursor que es procesado por la cas-pasa-1 en un Asp-X (donde X es normalmente unresiduo pequeño e hidrofóbico), para producir unpolipéptido maduro de 17 kDa derivado del extre-mo carboxilo, que es inmediatamente transporta-do al exterior de la célula. La intervención de lacaspasa-1 en el procesamiento de la IL-1 de ma-míferos sugiere que su procesamiento postrans-duccional lleva asociada la muerte celular porapoptosis (Laliberte, Eggler y Gabel, 1999). Sin em-bargo, la IL-1 de dorada carece de la secuencia dereconocimiento y corte de la caspasa-1, al igual que otras secuencias de vertebrados inferiores (Weining et al., 1998; Zou et al., 1999, 2000; Fujikiet al., 2000). Por lo tanto, el sitio de procesamientoy el mecanismo de liberación en estos animales es-tá por descubrir.Los ejemplares de dorada infectados con L. an-guillarum muestran una expresión variable deltranscrito de la IL-1 en sus tejidos. La mayor ex-presión aparece en exudado peritoneal y en célulasP. Pelegrín et al. Citoquinas recombinantes y prevención de infecciones en pisciculturaBol. Inst. Esp. Oceanogr. 18 (1-4). 2002: 189-193192Figura 4. Expresión in vivo de la IL-1 endistintos tejidos. Los ensayos de RT-PCR sellevaron a cabo con cADN de distintos teji-dos de peces no infectados (C, D) o infec-tados durante 24 h con L. anguillarum (A,B). Los productos fueron obtenidos con loscebadores F3 y R2 para la IL-1 de dorada(A, C) o con los cebadores para amplificarla -actina (B, D). Los resultados son repre-sentativos de dos experimentos indepen-dientes. (RC): riñón cefálico; (EP): exuda-do peritoneal; (Br): branquia; (bp): pares de bases.---10 20  3010  20  30  10  20 30 10  20 30  10  20 30  10  20 3010 20  3010 20  30  10 20  30  10 20  30  10 20  30  10 20  30LPS---LPS MAF LPS + MAFMacrófagosRCIL-1ββ-actinaCiclos de PCR:Ciclos de PCR:Figura 5. Expresión in vitro de la IL-1. Los experimentos de RT-PCR fueron realizados con cADN de macrófagos o célulasde riñón cefálico no estimulados o estimulados con LPS (lipopolisacáridos) y MAF (factor activador de los macrófagos). Serecogieron alícuotas de 10 ml después de 10, 20 y 30 ciclos de PCR. Los productos fueron obtenidos con los cebadores F3 yR2 para la IL-1 (A) o con los cebadores para la b-actina (B). (RC): riñón cefálico. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.de la sangre periférica, lo cual no es de extrañar yaque la bacteria fue inyectada intraperitonealmentey es una cepa no virulenta incapaz de abandonaresta cavidad y colonizar otros órganos del pez. Elaumento en sangre es más difícil de explicar, peroes lógico pensar que mediadores solubles produ-cidos por las células del exudado peritoneal enrespuesta a la bacteria podrían alcanzar los vasossanguíneos locales activando a los leucocitos circu-lantes. Un resultado inesperado fue que el trans-crito de la IL-1 también fue encontrado en algu-nos de los tejidos de los ejemplares no infectados,en contraste con recientes estudios en trucha queno han encontrado expresión basal del transcritode la IL-1 (Zou et al., 1999).Los monocitos y macrófagos son las principalescélulas encargadas de producir IL-1, pero la in-formación acerca de los tipos celulares que produ-cen esta molécula en peces es escasa. En este estu-dio, los macrófagos de dorada presentan unamayor expresión del transcrito de la IL-1 que lascélulas totales de riñón cefálico, sugiriendo queson las principales células productoras de IL-1 enpeces. Por otra parte, la expresión de la IL-1 enlos macrófagos de dorada aumenta tras ser estimu-lados con LPS y MAF, siendo ésta la primera de-mostración de que las citoquinas producidas porlinfocitos de peces activados son capaces de regularpositivamente la producción de IL-1 por los ma-crófagos. Dicho resultado sugiere que las linfoqui-nas producidas en el curso de una infección pue-den regular la producción in vivo de esta moléculaproinflamatoria.AGRADECIMIENTOSAl profesor C. Secombes (Universidad de Aber-deen, Reino Unido) por cedernos la secuencia delos cebadores F13 y R, y a los profesores. A. E. To-ranzo y J. L. Barja por la bacteria. Este estudio ha si-do realizado gracias a la financiación del Ministeriode Ciencia y Tecnología (Proyecto PB98-0387 y unabeca de FPI –formación de personal investigador–)y a una beca concedida por la Fundación Séneca,Centro de Coordinación de la Investigación.BIBLIOGRAFÍAFujiki, K., D. H. Shin, M. Nakao y T. Yano. 2000. Molecularcloning and expression analysis of carp (Cyprinus carpio)interleukin-1 beta, high affinity immunoglobulin E Fc re-ceptor gamma subunit and serum amyloid A. FishShellfish Immunol. 10: 229-242.Laliberte, R. E., J. Eggler y C. A. Gabel. 1999. ATP treatmentof human monocytes promotes caspase-1 maturationand externalization. J. Biol. Chem. 274: 36944-36951.Weining, K. C., C. Sick, B. Kaspers y P. Staeheli. 1998. A chic-ken homolog of mammalian interleukin-1 beta: cDNAcloning and purification of active recombinant protein.Eur. J. Biochem. 258: 994-1000.Zou, J., P. S. Grabowski, C. Cunningham y C. J. Secombes.1999. Molecular cloning of interleukin 1beta from rain-bow trout Oncorhynchus mykiss reveals no evidence of anICE cut site. Cytokine 11: 552-560.Zou, J., S. Bird, R. Minter, J. Horton, C. Cunningham y C. J.Secombes. 2000. Molecular cloning of the gene for in-terleukin-1 beta from Xenopus laevis and analysis of ex-pression in vivo and in vitro. Immunogenetics 51: 332-338.P. Pelegrín et al. Citoquinas recombinantes y prevención de infecciones en pisciculturaBol. Inst. Esp. Oceanogr. 18 (1-4). 2002: 189-193 193

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