To propose a standardized protocol for the evaluation of Legionella contamination in air

Albertini, R

Cannova, L

Cristina, M.L

De Giglio, O

Delia, S.A

Deriu, M.G

Giuliano, A

Guida, M

Lagan\ue0, P

Liguori, G

Montagna, M.T

Mura, I

Napoli, C

Pasquarella, C

Pennino, F

Rossini, A

Tardivo, S

Torre, I

Torregrossa, M.V

Villafrate, M.R

Montagna, M. T

Deriu, M. G

Delia, S. A

Laganà, P

Torregrossa, M. V

Villafrate, M. R

Pasquarella, C.

CRISTINA, MARIA LUISA

Archivio istituzionale della ricerca - Università di Genova

Legionella spp. contamination in indoor air: preliminary results of an Italian multicenter study.[La contaminazione indoor da Legionella spp: risultati preliminari di una indagine multicentrica italiana]

Montagna, Maria Teresa

De Giglio, Osvalda

Napoli, Christian

Cannova, Lucia

Cristina, Maria Luisa

Deriu, Maria Grazia

Delia, Santi Antonino

Giuliano, Ada

Guida, Marco

Laganà, Pasqualina

Mura, Ida

Pennino, Francesca

Rossini, Angelo

Tardivo, Stefano

Torre, Ida

Torregrossa, Maria Valeria

Villafrate, Maria Rosaria

Albertini, Roberto

Pasquarella, Cesira

LIGUORI, Giorgio

Archivio della ricerca - Università degli studi di Napoli &quot;Parthenope&quot;

[Legionella spp. contamination in indoor air: preliminary results of an Italian multicenter study]

OBJECTIVE: To propose a standardized protocol for the evaluation of Legionella contamination in air.

DESIGN: A bathroom having a Legionella contamination in water >1,000 cfu/l was selected in 10 different healthcare facilities. Air contamination was assessed by active (Surface Air System, SAS) and passive (Index of Microbial Air, IMA) sampling for 8 hours, about 1 m away from the floor and 50 cm from the tap water. Two hundred liters of air were sampled by SAS every 12 min, after flushing water for 2 min. The IMA value was calculated as the mean value of colony forming units/16 plates exposed during sampling (2 plates/hour). Water contamination was evaluated at T0, after 4 and 8 hours, according to the standard methods.

RESULTS: Air contamination by Legionella was found in three healthcare facilities (one with active and two with passive sampling), showing a concomitant tap water contamination (median=40,000; range 1,100-43,000 cfu/l). The remaining seven hospitals isolated Legionella spp. exclusively from water samples (median=8,000; range 1,200-70,000 cfu/l).

CONCLUSIONS: Our data suggest that environmental Legionella contamination cannot be assessed only through the air sampling, even in the presence of an important water contamination

Laganà, Pasqualina

Liguori, Giorgio

ALBERTINI, Roberto

PASQUARELLA, Cesira Isabella Maria

Archivio istituzionale della Ricerca -  Università degli Studi di Parma

NAPOLI, CHRISTIAN

Archivio della ricerca- Università di Roma La Sapienza

Montagna, M.

Giglio, O.

Napoli, C.

Cristina, M.

Deriu, M.

Delia, S.

Giuliano, A.

Guida, M.

Laganà, P.

Liguori, G.

Mura, I.

Pennino, F.

Rossini, A.

Tardivo, S.

Torre, I.

Villafrate, M.

Albertini, R.

CANNOVA, Lucia

TORREGROSSA, Maria Valeria

Archivio istituzionale della ricerca - Università di Palermo

WWW.EPIPREV.IT62Epidemiol Prev 2014; 38(6) Suppl 2: x-xxx ATTI DEL 47° CONGRESSO NAZIONALE SITIanno 38 (6) novembre-dicembre 2014e&pLa contaminazione indoor da Legionella spp:risultati preliminari di una indaginemulticentrica italianaLegionella spp contamination in indoor air: preliminaryresults of an italian multicenter studyMaria Teresa Montagna,1 Osvalda De Giglio,1 Christian Napoli,1 Lucia Cannova,2 Maria Luisa Cristina,3Maria Grazia Deriu,4 Santi AntoninoDelia,5 Ada Giuliano,6Marco Guida,7 Pasqualina Laganà,5 Giorgio Liguori,8Ida Mura,4 Francesca Pennino,9 Angelo Rossini,10 Stefano Tardivo,11 Ida Torre,9 Maria Valeria Torregrossa,12Maria Rosaria Villafrate,12 Roberto Albertini,13 Cesira Pasquarella141Dipartimento di scienze biomediche e oncologia umana, Sezione di igiene, Università degli studi di Bari; 2Dipartimentodi scienze per la promozione della salute, Sezione di igiene, Università degli studi di Palermo; 3Dipartimento di scienzedella salute, Università degli studi di Genova; 4Dipartimento di scienze biomediche, Sezione di igiene, Università deglistudi di Sassari; 5Dipartimento di scienze biomediche e delle immagini morfologiche e funzionali, Università degli studidi Messina; 6Dipartimento di prevenzione, servizio di igiene e sanità pubblica, Azienda sanitaria locale Salerno;7Dipartimento di biologia, Università degli studi di Napoli “Federico II”; 8Dipartimento di scienze motoriee del benessere, Università “Parthenope”, Napoli; 9Dipartimento di sanità pubblica, Università degli studi di Napoli“Federico II”; 10Istituto di ricovero e cura a carattere scientifico, Fondazione Santa Lucia, Roma; 11Dipartimento di sanitàpubblica e medicina di comunità, Università degli studi di Verona; 12Unità operativa “Controllo igiene ospedaliera”,Azienda ospedaliera universitaria Policlinico “P. Giaccone”, Palermo; 13Dipartimento di medicina clinica e sperimentale,Università degli studi di Parma, UO clinica e immunologia medica, Azienda ospedaliero-universitaria di Parma,Presidente dell’Associazione Italiana di Aerobiologia; 14Dipartimento di scienze biomediche, biotecnologichee traslazionale, Università degli studi di Parma, Coordinatore nazionale GISIO-SItI (Gruppo Italiano Studio IgieneOspedaliera della Società Italiana di Igiene, Medicina Preventiva e Sanità Pubblica).Corrispondenza: Maria Teresa Montagna; e-mail: igiene.dimo@uniba.itRiassuntoObiettivo. Rilevare la presenza di Legionella spp nell’aria attraverso un protocollo standardizzato, a fianco dei tradizionali me-todi impiegati per la rete idrica.Disegno. In dieci strutture sanitarie è stato selezionato un bagno, la cui acqua presentava una contaminazione da legionella >1.000unità formanti colonie (ufc)/l. La contaminazione dell’aria è stata valutata tramite campionamento attivo (surface air system, SAS)e passivo, impiegando piastre di sedimentazione per la valutazione IMA (index microbial air). I campionamenti sono stati effet-tuati per 8 ore consecutive, a circa 1 m di distanza dal pavimento e a 50 cm dal rubinetto. Con il campionamento attivo, 200litri di aria erano aspirati ogni 12 min, dopo flussaggio dell’acqua per 2 min. Il valore IMA era calcolato come valore medio diufc/16 piastre esposte nel corso del campionamento (due per ogni ora). La contaminazione dell’acqua è stata valutata al T0, dopo4 e 8 ore, secondo le linee guida del 2000.Risultati. Legionella spp è stata rilevata nell’aria di tre strutture sanitarie (in una con il metodo SAS, in due con il metodo IMA),la cui contaminazione idrica è risultata compresa tra 1.100 e 43.000 ufc/l (mediana=40.000). I restanti sette ospedali hannoriportato una contaminazione da Legionella solo nell’acqua (mediana=8.000; range 1.200-70.000 ufc/l), mai nell’aria circo-stante.Conclusioni. I nostri dati suggeriscono che la valutazione della contaminazione ambientale da Legionella spp, quando effettua-ta esclusivamente attraverso il campionamento dell’aria, porta a una sottostima del rischio, anche in presenza di un elevato gra-do di contaminazione idrica.(Epidemiol Prev 2014; 38(6) Suppl 2: 62-65)Parole chiave: Legionella, aria, acquaAbstractObjective. To propose a standardized protocol for the evaluation of Legionella contamination in air. .Design. A bathroom having a Legionella contamination in water >1,000 cfu/l was selected in 10 different healthcare facili-ties. Air contamination was assessed by active (surface air system, SAS) and passive (index of microbial air, IMA) sampling63 ATTI DEL 47° CONGRESSO NAZIONALE SITIEpidemiol Prev 2014; 38(6) Suppl 2: x-xxxArticoli originali anno 38 (6) novembre-dicembre 2014e&pfor 8 hours, about 1 m away from the floor and 50 cm from the tap water. Two hundred liters of air were sampled by SASevery 12 min, after flushing water for 2 min. The IMA value was calculated as the mean value of colony forming units/16 platesexposed during sampling (2 plates/hour). Water contamination was evaluated at T0, after 4 and 8 hours, according to thestandard methods.Results. Air contamination by Legionella was found in three healthcare facilities (one with active and two with passive sampling),showing a concomitant tap water contamination (median=40,000; range 1,100-43,000 cfu/l). The remaining seven hospitalsisolated Legionella spp. exclusively from water samples (median=8,000; range 1,200-70,000 cfu/l).Conclusions. Our data suggest that environmental Legionella contamination cannot be assessed only through the air sampling,even in the presence of an important water contamination.(Epidemiol Prev 2014; 38(6) Suppl 2: 62-65)Key words: Legionella, air, wateralcuni autori hanno campionato l’acqua di condensa piuttostoche l’aria circostante.12Considerato che anche in letteratura sono indicate le oggettivedifficoltà legate alla determinazione di Legionella spp. nel-l’aria13 e alle diverse modalità di campionamento,11,14-16 que-sto studio si propone di standardizzare un protocollo di cam-pionamento dell’aria che consenta di rilevare la presenza diLegionella aerodispersa quando nell’ambiente circostante è pre-sente una rete idrica contaminata. Inoltre, il confronto con i ri-sultati del classico campionamento dell’acqua permetterà di va-lutare anche l’attendibilità del campionamento dell’aria incorso di indagini epidemiologiche.MATERIALI E METODIDisegno dello studioSono stati arruolati 10 ospedali distribuiti a livello nazionale.Ciascuna sede ha identificato un bagno che presentava unacontaminazione idrica da Legionella spp. >1.000 ufc/l.Il protocollo di studio prevedeva tre fasi: campionamento dell’acqua e dell’aria circostante; isolamento, identificazione e conservazione dei ceppi; analisi dei risultati.Campionamento dell’acqua e dell’ariaUna volta identificato il bagno, sono state rilevate le sue di-mensioni e il numero di porte e finestre presenti, quindi si èproceduto al campionamento dell’aria e, in parallelo, della cor-rispondente fonte di acqua, avendo cura di tenere chiusi porte,finestre e altri rubinetti presenti nel bagno. Inoltre, sono stateregistrate eventuali aperture della porta di ingresso.Campionamento dell’ariaLa contaminazione dell’aria è stata valutata mediante cam-pionamento attivo e passivo per un periodo complessivo di 8ore (dalle 9.00 alle 17.00).17Il campionamento attivo è stato effettuato tramite surface airsystem (SAS, International PBI, Milano, Italia), collocato a 1m da terra e a 50 cm di distanza dal rubinetto. La portata è stataimpostata a 180 l/min, seguendo un cronoprogramma prefis-sato: ogni 12 minuti, e previo flussaggio dell’acqua per due mi-nuti, sono stati aspirati 200 l di aria, per un totale di 1.000 l/h,avendo cura di cambiare la piastra al termine di ciascuna ora diINTRODUZIONELegionella spp è un microrganismo intracellulare che vive inambienti acquatici naturali (fiumi, laghi, stagni) e artificiali(rubinetti, docce, idromassaggi, torri di raffreddamento, ap-parecchi medicali ecc.) e predilige una temperatura com-presa tra 25°C e 42°C, soprattutto se l’acqua è stagnante ericca di sedimenti.1La malattia si trasmette attraverso l’inalazione di aerosol con-taminato; fattori individuali e patologie predisponenti sonoalla base della diversa suscettibilità dell’ospite esposto alla me-desima fonte di contagio.2Delle 58 specie e 70 sierogruppi (sg) attualmente noti, Legio-nella pneumophila sg1 e sg6 risultano i principali responsabilidi malattia nell’uomo.3 Oltre alle comuni specie di Legionellaun tempo ritenute ambientali e già da tempo associate a casiumani, di recente sono state identificate ulteriori specie (L. car-diaca, L. nagasakiensis, L. steelei) in pazienti immunocompro-messi affetti da legionellosi.4-6La legionellosi è sottoposta a sistemi speciali di sorveglianza siainternazionale sia nazionale. In Europa, è attivo l’European Le-gionella disease network (ELDSnet), un sistema coordinatodall’European centre for disease control and prevention(ECDC) di Stoccolma che raccoglie informazioni sui casi dilegionellosi associati a viaggi e turismo. In Italia, il Sistema na-zionale di sorveglianza è stato istituito nel 1983 e dal 1990 lamalattia rientra tra quelle infettive e diffusive di classe II, perle quali sussiste obbligo di notifica.I documenti nazionali relativi al controllo e prevenzione dellalegionellosi7 prevedono il campionamento di matrici ambien-tali (acqua, incrostazioni, depositi, superfici ecc.) ma non del-l’aria, sebbene negli anni successivi alcuni autori abbiano evi-denziato la presenza di Legionella nell’aria indoor e outdoor.8,9Probabilmente, la scelta di prediligere i controlli sulla reteidrica, rispetto ad altre matrici ambientali, trova il suo razionalenelle caratteristiche ecologiche del microrganismo che, colo-nizzando gli ambienti acquatici, permette in tal modo di risa-lire alla sorgente di infezione. Inoltre, essendo stata dimostratauna estrema variabilità delle cariche di Legionella spp. nelle retiidriche,10 potrebbe verificarsi che basse concentrazioni del mi-crorganismo nelle acque non siano rilevate con il campiona-mento dell’aria.11 Infatti, in alcune indagini effettuate in oc-casione di eventi epidemici correlati a torri di raffreddamento,campionamento. Complessivamente, sono state effettuate 40aspirazioni su un totale di 8 piastre (5 aspirazioni/piastra/h). Ilnumero delle colonie presenti su ogni piastra è stato calcolatoin base alla tabella di conversione fornita dalla ditta produttriceed espresso in ufc/m3.Il campionamento passivo è stato effettuato utilizzando piastredi sedimentazione (del diametro di 9 cm) per la determina-zione dell’indice microbico aria (IMA).18 Due piastre/h sonostate poste a 1 m di altezza dal pavimento e a 50 cm di distanzadal rubinetto selezionato. Il risultato è stato ricavato dallamedia dei valori rilevati sulle 16 piastre/8 h ed espresso in unitàformanti colonie (ufc) per piastra.Campionamento dell’acquaNell’arco delle otto ore previste dal protocollo di studio l’acquacalda del rubinetto è stata campionata tre volte: T0, prima diavviare il primo campionamento dell’aria; T1, dopo 4 ore; T2,dopo 8 ore dal termine del campionamento dell’aria.La ricerca di Legionella spp. è stata eseguita secondo quanto ri-portato nelle Linee guida per la prevenzione e controllo dellalegionellosi.7Isolamento, identificazione e conservazionedi Legionella sppPer l’isolamento di Legionella spp sono state utilizzate piastrecontenenti GVPC (Glycine-Vancomycin-Polymyxin-Cyclo-heximide medium, Liofilchem Srl, Teramo, Italia). Dopo in-cubazione a 36°C per 10 giorni in ambiente umido e CO2 al2,5%, le colonie sospette sono state sottocoltivate su CYE(Charcoal Yeast Extract medium, Liofilchem Srl, Teramo, Ita-lia) e BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract medium, Liofil-chem Srl, Teramo, Italia); quelle ascrivibili al genere legionellasono state sottoposte a identificazione tramite antisieri poliva-lenti (Oxoid Spa, Milano, Italia).Dopo tipizzazione sierologica, i ceppi isolati sono stati conge-lati a -80°C secondo due modalità: il ceppo di fresco isolamentoè stato stemperato sia in 1,5 ml di latte scremato sterile sia in0,2 ml di glicerolo + 1,8 ml di acqua distillata. Sono stati im-piegati entrambi i metodi in quanto la sopravvivenza dei ceppipuò essere condizionata dalla modalità di conservazione.RISULTATIL. pneumophila sg2-14 è stata rilevata nell’aria e nell’acqua ditre dei 10 bagni esaminati: il primo, positivo con il campio-namento passivo (1 ufc/piastra), presentava una contamina-zione idrica pari a 1.100 ufc/l (T0), 400 ufc/l (T1), 800 ufc/l(T2); il secondo, positivo con il campionamento passivo (1,85ufc/piastra), presentava una contaminazione idrica pari a40.000 ufc/l (T0), 500 ufc/l (T1), 700 ufc/l (T2); il terzo, po-sitivo con il campionamento attivo (2 ufc/m3), presentava unacontaminazione idrica pari a 43.000 ufc/l (T0), 140.000 ufc/l(T1), 160.000 ufc/l (T2).Nei restanti sette bagni L. pneumophila sg1 e sg2-14 sono stateriscontrate solo nell’acqua di rubinetto con valori mediani dicontaminazione pari a: 6.800 ufc/l (T0, range 1.200-12.000);1.900 ufc/l (T1, range 100-6.700); 1.200 ufc/l (T2, range 0-6.400).DISCUSSIONE E CONCLUSIONILe oggettive difficoltà nel rilevare la presenza di Legionellaspp in campioni di aria sono già ampiamente descritte in let-teratura e sono in relazione alla possibile contaminazionedelle piastre da parte di batteri o miceti.13 Infatti, nonostantesi faccia uso di terreni selettivi, il mancato trattamento al ca-lore, solitamente impiegato quando si analizzano i campionidi acqua, può favorire la riproduzione di altre specie batte-riche, inibendo la crescita di Legionella spp. In particolare, ènota l’attività antagonista di Pseudomonas aeruginosa su Le-gionella spp.19Nel nostro studio, la contemporanea contaminazione battericae/o micotica non ha impedito la rilevazione di Legionella, sianei campioni di aria positivi sia nei campioni di acqua. Inol-tre, il grado di contaminazione della rete idrica da Legionellanon appare direttamente proporzionale alla contaminazionedell’aria. Sebbene alcuni autori abbiano riportato che basseconcentrazioni di Legionella spp nelle acque non sono rileva-bili con il campionamento dell’aria,9,11 nel nostro caso la pre-senza di Legionella nell’aria è stata rilevata anche con unacontemporanea contaminazione idrica pari a 400 ufc/l.Per quanto riguarda i diversi metodi utilizzati per il campio-namento dell’aria, alcuni autori hanno confrontato i valoridelle conte microbiche ottenuti con il campionamento attivoe passivo (tramite SAS e piastre di sedimentazione), dimo-strando che non sempre i dati sono sovrapponibili.14 A nostroavviso, i due sistemi non sono da ritenersi contrapposti, maciascuno deve essere preso in considerazione per i propri van-taggi e limiti e in relazione alle condizioni di utilizzo. Inoltre,nel nostro studio, nel bagno risultato positivo con il campio-namento attivo l’apertura della porta non sembra aver influitosul riscontro di Legionella nell’aria.In conclusione, i nostri dati suggeriscono che la valutazionedella contaminazione ambientale da Legionella spp, quandoeffettuata esclusivamente attraverso il campionamento del-l’aria, porta a una sottostima del rischio, anche in presenzadi un elevato grado di contaminazione idrica. Il campiona-mento dell’aria può essere un utile ausilio di indagine incorso di cluster epidemici, purché si effettui in parallelo uncontrollo della rete idrica. In attesa di perfezionare protocollistandardizzati e condivisi, valutando anche metodi alterna-tivi di campionamento (es: gorgogliamento, filtrazione ecc.),saranno condotti studi molecolari sui ceppi isolati dall’ariae dall’acqua.Confitti di interesse: nessuno64 ATTI DEL 47° CONGRESSO NAZIONALE SITIEpidemiol Prev 2014; 38(6) Suppl 2: x-xxxArticoli originali anno 38 (6) novembre-dicembre 2014e&p65 ATTI DEL 47° CONGRESSO NAZIONALE SITIEpidemiol Prev 2014; 38(6) Suppl 2: x-xxxArticoli originali anno 38 (6) novembre-dicembre 2014e&p1. Napoli C, Fasano F, Iatta R et al. Legionella spp. and legionellosis in south-eastern Italy: disease epidemiology and environmental surveillance in com-munity and health care facilities. BMC Public Health 2010;10:660.2. Fonseca MV, Swanson MS. Nutrient salvaging and metabolism by the intra-cellular pathogen Legionella pneumophila. Front Cell Infect Microbiol 2014;4:12.3. Messi P, Bargellini A, Anacarso I et al. Protozoa and human macrophages in-fection by egionella pneumophila environmental strains belonging to differ-ent serogroups. Arch Microbiol 2012;195(2):89-96.4. Pearce MM,Theodoropoulos N, Mandel MJ et al. Legionella cardiaca sp. nov.,isolated from a case of native valve endocarditis in a human heart. Int J SystEvol Microbiol 2012;62(Pt 12):2946-54.5. Yang G, Benson RF, Ratcliff RM et al. Legionella nagasakiensis sp. nov., iso-lated from water samples and from a patient with pneumonia. Int J Syst EvolMicrobiol 2012;62(Pt 2):284-88.6. Edelstein PH, Edelstein MA, Shephard LJ et al. Legionella steelei sp. nov., iso-lated from human respiratory specimens in California, USA, and South Aus-tralia. Int J Syst Evol Microbiol 2012;62(Pt 8):1766-71.7. Linee guida nazionali per la prevenzione e il controllo della legionellosi. GUn.103 del 5.5.2000.8. Crimi P, Macrina G, Grieco A et al. Correlation between Legionella contami-nation in water and surrounding air. Infect Control Hosp Epidemiol 2006;27(7): 771-73.9. Palmore TN, Stock F, White M et al. A cluster of cases of nosocomial legion-naires disease linked to a contaminated hospital decorative water fountain.Infect Control Hosp Epidemiol 2009;30:764-68.10. Napoli C, Iatta R, Fasano F et al. Variable bacterial load of Legionella spp. ina hospital water system. Sci Total Environ 2009;408:242-44.11. Pasquarella C, Veronesi L, Castiglia P et al. Italian multicentre study on mi-crobial environmentalc ontamination in dental clinics: a pilot study. Sci TotalEnviron 2010; 408:4045-51.12. McCormick D, Thorn S, Milne D et al. Public health response to an outbreakof Legionnaires’ disease in Edinburgh, United Kingdom, June 2012. Euro Sur-veill 2012;17(28):pii=20216.13. Chang CW, Chou FC.Methodologies for quantifying culturable, viable, and to-tal Legionella pneumophila in indoor air. Indoor Air 2011; 21:291-99.14. Napoli C, Marcotrigiano V, Montagna MT. Air sampling procedures to evalu-ate microbial contamination: a comparison between active and passive meth-ods in operating theatres. BMC Public Health 2012;12:594.15. Pasquarella C, Veronesi L, Napoli C et al. Microbial environmental contami-nation in Italian dental clinics:A multicenter study yielding recommendationsfor standardized sampling methods and threshold values. Sci Total Environ2012;420:289-99.16. Pasquarella C,Albertini R, Dall’Aglio P et al. Air microbial sampling: the stateof the art. Ig Sanità Pubbl 2008;64:79-120.17. UNI EN ISO 14698-1: 2004. Camere bianche ed ambienti associati control-lati - Controllo della biocontaminazione - Parte 1: principi generali e metodi.18. Pasquarella C, Pitzurra O, Savino A. The index of microbial air contamination.J Hosp Infect 2000;46:241-56.19. Kimura S, Tateda K, Ishii Y et al. Pseudomonas aeruginosa Las quorum sens-ing autoinducer suppresses growth and biofilm production in Legionellaspecies. Microbiology 2009;155:1934-39.Bibliografia/References

La contaminazione indoor da Legionella spp: risultati preliminari di una indagine multicentrica italiana
Legionella spp contamination in indoor air: preliminary
results of an italian multicenter study

https://iris.unipa.it/retrieve/handle/10447/107536/149900/articolo%20SItI%20aria%20MONTAGNA.pdf

Legionella spp. contamination in indoor air: preliminary results of an Italian multicenter study.[La contaminazione indoor da Legionella spp: risultati preliminari di una indagine multicentrica italiana]

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