Transglutaminase 2 (TGase 2), auch Gewebstransglutaminase genannt, gehört zur Familie der Transglutaminasen und bewirkt eine calciumabhängige Transamidierung zwischen proteingebundenen Glutaminylresten und vielfältigen primären Aminen. Zu diesen zählen proteingebundene Lysinreste sowie niedermolekulare Polyamine wie Cadaverin. Über diese namensgebenden Funktion hinaus, führt TGase 2 Deamidierungen proteingebundener Glutaminylreste aus. Neben diesen katalytischen Funktionen ist TGase 2 an Adhäsion-vermittelnden Protein-Protein-Interaktionen sowie an Signalweiterleitungsaktivitäten, unter anderem im Rahmen G-Protein-Funktion beteiligt. TGase 2 wird konstitutiv im ganzen Körper exprimiert und reguliert physiologischerweise unter anderem Apoptose und Wundheilung.
TGase 2 wird darüber hinaus mit vielfältigen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, darunter Zöliakie, Fibrosen, diverse neurodegenerative Erkrankungen sowie Krebs. Dabei steht lediglich bei letzterem die Signalweiterleigungsfunktion im Vordergrund, während bei den anderen Krankheiten die Transamidasefunktion der TGase 2 im Fokus steht.
Die vorliegende Arbeit umfasst den Aufbau eines prokaryotischen Expressionssystems humaner TGase 2 und die Entwicklung zweier Fluoreszenzanisotropie-basierten, hochdurchsatzfähigen Assayverfahren zur Quantifizierung der Transamidaseaktivität sowie der GTP-Bindungsfunktion.
Der Transamidaseassay wurde dabei initial mit TGase 2 aus Meerschweinchenleber, dem gängigsten Modellenzym humaner TGase 2, etabliert und später auf rekombinante humane TGase 2 angewendet. Die Entwicklung umfasste dabei die Synthese dreier teils neuartiger fluoreszenzmarkierter Cadaverine durch die Arbeitsgruppe von Herrn Dr. Reik Löser vom Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, die Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Substraten und Enzym, die Validierung mittels literaturbekannter Hemmstoffe, die Quantifizierung der Calciumabhängigkeit der Enzymaktivität sowie die Untersuchung einer Substanzbibliothek aus Nε-Acryloyl-lysinpiperaziden hinsichtlich ihrer Hemmung der Transamidaseaktivität von TGase 2. Der entwickelte Assay wurde darüber hinaus auf vier weitere Transglutaminasen übertragen und ausgewählte Hemmstoffe hinsichtlich ihrer Selektivität für TGase 2 hin untersucht. Schließlich erfolgten Demonstrationen der Tauglichkeit des Assays für Hochdurchsatzverfahren sowie zur Bestimmung der aktiven Enzymkonzentration.
Der GTP-Bindungsassay wurde in Ermangelung eines literaturbekannten Modells direkt mit rekombinanter humaner TGase 2 etabliert. Die Entwicklung dieses Assays umfasste dabei die Synthese neuartiger fluoreszenzmarkierter Liganden zur Bindung an die GTP-Bindungsstelle von humaner TGase 2, die Charakterisierung der Bindungsstärke dieser Sonden, die Validierung durch literaturbekannter Hemmstoffe, eine Quantifizierung der Calciumabhängigkeit der GTP-Bindung humaner TGase 2 sowie die Synthese und Untersuchung einer Substanzbibliothek aus Analoga von Guanosindi- und triphosphat hinsichtlich ihrer Bindungsaffinität zu humaner TGase 2. Schließlich erfolgten Untersuchung zur Tauglichkeit für Hochdurchsatzverfahren.
Sämtliche Synthesen bezüglich des GTP-Bindungsassays wurden dabei dankenswerterweise durch die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Jacek Jemielity von der Universität Warschau durchgeführt
