Florek, Ewa

Gomółka, Ewa

Piekoszewski, Wojciech

Synowiec, Anna

Zięba, Andrzej

Zyss, Tomasz

Jagiellonian Univeristy Repository

1004 Przegląd Lekarski  2012 / 69 / 10 A. Synowiec i wsp.PRACE  ORYGINALNEZastosowanie metody HPLC-UV do oznaczania arypiprazolu w surowicyApplication of HPLC-UV method for aripiprazole determination in serum1Zakład Chemii Analitycznej, Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński, KrakówKierownik: Prof. dr hab. Paweł Kościelniak2Pracownia Toksykologii Analitycznej i Terapii Monitorowanej, Katedra Toksykologii i Chorób Środowiskowych, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, KrakówKierownik Pracowni:Dr Ewa Gomółka3Pracownia Toksykologii, Zakład Diagnostyki, Szpital Uniwersytecki, KrakówKierownik Pracowni: Dr Ewa Gomółka4Klinika Psychiatrii Dorosłych, Katedra Psychiatrii, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, KrakówKierownik Kliniki: Prof. dr hab. n. med. Andrzej Zięba5Laboratorium Badań Środowiskowych,Katedra i Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego, PoznańKierownik Laboratorium:Prof. dr hab. Ewa Florek6Pracownia Wysokorozdzielczej Spektrometrii Mas, Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński, KrakówKierownik Pracowni:Prof. dr hab. n. med. Wojciech PiekoszewskiDodatkowe słowa kluczowe:arypiprazolHPLCmonitorowanie stężenia lekuAdditional key words:aripiprazoleHPLCtherapeutic drug monitoringAdres do korespondencji:dr Ewa GomółkaPracownia Toksykologii Analitycznej i Terapii MonitorowanejUniwersytet Jagielloński Collegium Medium31-501 Krakówul. Śniadeckich 6e-mail: ewa.gomolka@uj.edu.plAnna SYNOWIEC1Ewa GOMÓŁKA2, 3Tomasz ZYSS4Andrzej ZIĘBA4Ewa FLOREK5Wojciech PIEKOSZEWSKI1,6Arypiprazol jest jednym z najnow-szych leków stosowanych w terapii schizofrenii. Lek ten nie posiada bezwzględnych wskazań do moni-torowania stężenia w trakcie terapii. Pomimo tego, dla oceny skuteczności stosowanych dawek wskazane jest sprawdzenie, w jaki sposób stężenie arypiprazolu koreluje ze stanem kli-nicznym pacjenta. Badanie stężenia leku w trakcie terapii pozwala na unik-nięcie przekroczenia stężeń terapeu-tycznych w surowicy i wyeliminowanie efektów niepożądanych oraz jest formą kontroli, czy pacjent stosuje zalecone przez lekarza dawki leku.Celem pracy było opracowanie pro-stej metody oznaczania arypiprazolu w surowicy na potrzeby prowadzenia kontroli stężenia leku w trakcie tera-pii. Zastosowano metodę wysoko-sprawnej chromatografii cieczowej z detekcją spektrofotometryczną (HPLC-UV), rozdział prowadzono na kolumnie LC-8 w warunkach izokratycznych, przy przepływie 1,2 ml/min. Faza ru-choma zawierała mieszaninę 0,025M buforu trietyloamonowego i aceto-nitrylu w stosunku 62:38. Pomiarów dokonywano przy długość fali λ=214 nm; jako wzorzec wewnętrzny zasto-sowano promazynę. Parametry walida-cyjne metody: zakres liniowości (LOL) 100-800 ng/ml, granica detekcji (LOD) 10 ng/ml, granica oznaczalności (LOQ) 100 ng/ml. Współczynniki zmienności (CV) określające dokładność i precyzję metody nie przekraczały 10%. Sprawdzono przydatność opraco-wanej metody w praktyce klinicznej dla celów terapii monitorowanej stę-żeniem leku u pacjenta leczonego arypiprazolem. Aripiprazole is a new drug applied in schizophrenia treatment. There are not strict indications for aripiprazole therapeutic drug monitoring. Despite, serum aripiprazole measuring would help control the drug doses effective-ness. The drug monitoring can elimina-te overdosing, adverse effects and let control proper drug ingestion.The aim of the paper was to develop a simple method for aripiprazole deter-mination in serum for therapeutic drug monitoring. High performance liquid chromatography with spectrophoto-metric detection (HPLC-UV) was used. Resolution was performed on LC-8 column; moving phase was solution 0,025M trimethylammonium buffer : acetonitrile (62:38). Isocratic flow was 1,2 ml/min; internal standard (IS) was promazine; monitored wavelength was λ=214 nm.The validation parameters were: li-mits of linearity (LOL) 100-800 ng/ml, li-mit of detection (LOD) 10 ng/ml, limit of quantity (LOQ) 100 ng/ml. Coefficient of variation (CV) describing accuracy and precision didn’t cross 10%. The method was useful for thera-peutic drug monitoring in serum of patients treated with aripiprazole.WstępPreparaty z grupy atypowych leków przeciwpsychotycznych wyparły klasyczne neuroleptyki i od lat 90 ubiegłego wieku są szeroko stosowane w leczeniu schizofrenii. Badania wskazały, że atypowe leki przeciw-psychotyczne, do których należą risperidon, olanzapina, klozapina, amisulpryd, kwetiapi-na, ziprasidon, sertindol oraz arypiprazol są bezpieczniejsze w działaniu, nie zaburzają funkcji układu pozapiramidowego lub wywie-rają tylko niewielki wpływ [11]. Arypiprazol (Abilify) jest jednym z najnowszych leków stosowanych w farmakoterapii schizofrenii, dopuszczonym do stosowania przez FDA w 2002 roku natomiast w Unii Europejskiej w 2004 roku. Jest to związek chemiczny o nomenklaturze systematycznej wg (IUPAC) 7-[4-[4-(2,3-dichlorofenylo)piperazyn-1-ylo]butoksy]-3,4-dihydro-1H-chinolin-2-on ( Rycina 1.) [7]. Arypiprazol jest prekursorem nowej grupy neuroleptyków, tak zwanych stabilizatorów układu dopaminergicznego i serotoninergicznego, nazywany również 1005Przegląd Lekarski  2012 / 69 / 10lekiem przeciwpsychotycznym trzeciej generacji [1].Większość atypowych leków II gene-racji wywiera działanie sedatywne, co jest zjawiskiem niekorzystnym. Wiele danych wskazuje na problemy kliniczne związane z zaburzeniami przemiany materii pod postacią zespołu metabolicznego - m.in. przyrostu masy ciała, zaburzeń przemiany węglowodanów z hiperglikemią (u części chorych może rozwinąć się cukrzyca typu 2) oraz zaburzeń gospodarki lipidowej [5, 15]. Objawy niepożądane obniżają war-tość kliniczną tych leków. Ich stosowanie wymaga uwzględnienia przeciwwskazań i monitorowania stanu somatycznego. Jed-ną z form prowadzenia bezpiecznej terapii jest monitorowanie stężenia leku. Pomiar stężenia arypiprazolu jest pomocny przy uwzględnieniu osobniczych różnic aktywno-ści enzymów wpływających na metabolizm leku (zależny od genotypu i fenotypu) i ostatecznie pozwala określić bezpieczną dawkę leku dla danego pacjenta [3].Farmakokinetyka arypiprazoluArypiprazol dobrze wchłania się z prze-wodu pokarmowego, maksymalne stężenie w osoczu osiąga w ciągu 3-5 godzin po podaniu. Dostępność biologiczna wynosi około 87%. Spożywanie posiłków o dużej zawartości tłuszczu nie wpływa na farmako-kinetykę arypiprazolu. Objętość dystrybucji arypiprazolu wynosi 4,9 l/kg, co wskazuje na dystrybucję pozanaczyniową. Arypiprazol jest metabolizowany głównie w wątrobie na drodze dehydrogenacji, hydroksylacji oraz N-dealkilacji (Rycina 2), przy udziale enzymów CYP2D6 oraz CYP3A4 [4, 8]. W stanie stacjonarnym aktywny metabolit, dehydroarypiprazol, stanowi około 40% AUC arypiprazolu w osoczu. W stężeniach terapeutycznych arypiprazol i dehydroary-piprazol wiążą się w ponad 99% z białkami surowicy, głównie z albuminami. Biologiczny okres półtrwania arypiprazolu wynosi od 75 do 146 godzin i jest zależny od aktywności izoenzymu CYP2D6 i CYP 3A4. Całkowity klirens arypiprazolu wynosi 0,7 ml/min/kg. Mniej niż 1% niezmienionego arypiprazolu wydala się z moczem i około 18% z kałem [4].Celem pracy było opracowanie szybkiej i prostej metodyki oznaczania arypiprazolu w surowicy krwi oraz sprawdzenie przy-datności opracowanej metody dla celów kontroli terapii.Materiał i metodyDo oznaczenia arypiprazolu w surowicy zastosowa-no metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją spektrofotometryczną (HPLC-UV). Zastosowano chromatograf cieczowy Pump L-7100 (Merck-Hitachi). Rozdział prowadzono na kolumnie LC-8 (Supelco). Pra-cowano w warunkach izokratycznych przy przepływie 1,2 ml/min. Skład fazy ruchomej: 0,025M bufor trietyloamo-nowy (Fluka) : acetonitryl HPLC Grade (Sigma) (62:38). Monitorowano długość fali 214 nm. Objętość próbki wprowadzanej na kolumnę - 100 µl. Czas analizy - 25 min. Czasy retencji wynosiły odpowiednio 14,3 min dla arypiprazolu i 16,5 min dla IS. Rozdział chromatograficz-ny przedstawia Rycina 3. Przydatność metody sprawdzono na próbie surowicy krwi pacjenta leczonego arypiprazolem. Oznaczenia stę-żenia arypiprazolu prowadzono w Pracowni Toksykologii Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie.Procedura ekstrakcji arypiprazolu z surowicy Zastosowano metodę ekstrakcji ciecz-ciecz (L-L). Do 500 µl próby badanej (surowicy) dodano 50 µl roztworu promazyny o stężeniu 1 µg/ml, jako wzorca wewnętrznego (IS), próby alkalizowano 200 µl buforu TRIS (POCH), ekstrahowano 1 ml mieszaniny heksan (Sigma): alkohol izoamylowy (Merck) (99:1), wstrząsano przez 2 minuty i wirowano 5 min. przy 6 tys. rpm. Fazę organiczną odparowano w temp. 40oC w strumieniu sprężonego powietrza. Pozostałość po odparowaniu rozpuszczano w 300 µl fazy ruchomej.Rycina 1Wzór strukturalny arypiprazolu.Structural formula of arypiprazol.Rycina 2Metabolizm arypiprazolu.Metabolism of aripiprazole.Rycina 3Rozdział chromatograficzny badanej próby surowicy (1 – arypiprazol, 2 – promazyna (IS)).Chromatography resolution of serum sample (1 – aripiprazole, 2 – promazine (IS)).1006 Przegląd Lekarski  2012 / 69 / 10 A. Synowiec i wsp.Walidacja metodyKalibrację metody wykonano stosując metodę serii wzorców przygotowanych z surowicy wzbogaconej arypiprazolem dla otrzymania roztworów o stężeniach 100, 200, 500, 800 ng/ml. Współczynnik korelacji krzywej kalibracji wynosił 0,9967. Granicę wykrywalności (LOD) wyznaczono, jako 3-krotną wartość stosunku sygnału szumu do sygnału wzorca wewnętrznego (mierzone, jako powierzchnia pików). Granicę oznaczalności (LOQ) wyznaczono, jako dziesięciokrotną wartość stosunku sygnału szumu do sygnału wzorca wewnętrznego (mie-rzone, jako powierzchnia pików). Dokładność wyznaczono w oparciu o analizę 5-elementowych serii prób surowicy zawierających arypiprazol na poziomach 100 i 800 [ng/ml]. Dokładność obliczono ze wzoru: Dokładność = (Ct-Co)/Ct *100%, gdzie: Ct – teo-retyczna wartość stężenia, Co – wyznaczona wartość stężenia.Za miarę precyzji przyjęto współczynnik zmienności (CV). Precyzję metody badano dla dwóch różnych stężeń arypiprazolu, analizując te roztwory w 5-elementowych seriach w ciągu tego samego dnia oraz w odstępie 5 dni. Do obliczeń precyzji zastosowano wzór: CV = SD/Cśr *100%, gdzie: SD – odchylenie standardowe, Cśr – stężenie średnie. Parametry walidacyjne metody zebrano w Tabeli I.Omówienie i wnioskiArypiprazol jest lekiem przeciwpsycho-tycznym o nowoczesnym profilu farma-kologicznym, polegającym na połączeniu właściwości częściowego agonizmu o wysokim powinowactwie wobec receptorów dopaminowych D2 oraz serotoninowych 5HT1A z antagonizmem wobec recepto-rów 5HT2A [10, 12]. Ze względu na swój odmienny profil receptorowy arypiprazol może być interesującą alternatywą wobec pozostałych leków przeciwpsychotycznych, a nawet może być uznany za lek tzw. trzeciej generacji w leczeniu schizofrenii. Cechuje się dobrą tolerancją, powodując mniej objawów niepożądanych niż inne leki prze-ciwpsychotyczne, co sugeruje, że może być chętniej od innych neuroleptyków stosowany w leczeniu długoterminowym. Wyniki badań skuteczności arypiprazolu są zachęcające, wymagają jednak potwierdzenia w kolejnych próbach, na większych grupach badanych [1, 3, 12, 14].Metabolizm arypiprazolu jest zależny głównie od aktywności izoenzymu CYP2D6 i CYP 3A4 [4]. Enzymy te cechują się dużą zmiennością w populacji, zależną od geno-typu oraz fenotypu. Osobnicze różnice w metabolizmie arypiprazolu wpływają na bio-logiczny okres półtrwania leku, który waha się od 75 h (szybcy metabolizerzy) do 146 h (wolni metabolizerzy) [8, 10]. U pacjentów ze zmniejszoną aktywnością izoenzymów CYP2D6 i CYP3A4 dla odpowiedniego efektu klinicznego wymagane są niższe dawki leku. Wolni metabolizerzy narażeni są też na większe prawdopodobieństwo wystąpienia efektów niepożądanych: pobu-dzenie, bezsenność, objawy pozapiramido-we, akatyzja, zawroty i bóle głowy, nieostre widzenie, niestrawność, zgaga, nudności, wymioty, zaparcia, nadmierne wydzielanie śliny, uczucie zmęczenia [15, 16]. Opra-cowaną metodę oznaczania arypiprazolu można, więc wykorzystać dla zwiększenia skuteczności terapii i ograniczenia efektów niepożądanych. Techniki umożliwiające oznaczanie arypiprazolu w surowicy, to chromatografia cieczowa (HPLC-DAD, LC-MS) oraz elektro-foreza kapilarna [2, 6, 9, 13]. Terapeutyczne i toksyczne zakresy stężeń tego leku nie są znane, więc wyniki oznaczeń leku w surowi-cy odnosi się do efektów klinicznych. Dla oceny przydatności opisanej metody wykonano oznaczenie stężenia arypipra-zolu w surowicy pacjenta leczonego tym lekiem z powodu schizofrenii. Zmierzone stężenie wynosiło 836 ng/ml. Interpretacja uzyskanego wyniku została dokonana w oparciu o aktualną literaturę i stwierdzono, że wynik ten znacznie przekracza najwyższe opisane w literaturze poziomy arypiprazolu w surowicy [3, 8]. Stężenia arypiprazolu u pacjentów leczonych minimum 6 tygodni terapeutycznymi dawkami arypiprazolu (10 -30 mg/dzień) mieściły się w zakresie od 105 do 549 ng/ml [3, 8]. Nie oznacza to jednak, że oznaczone stężenie osiągnęło zakres toksyczny; górna granica zakresu stężeń terapeutycznych nie została dla arypiprazolu do tej pory określona. Arypiprazol, to stosunkowo nowy lek przeciwpsychotyczny. Skuteczność i bez-pieczeństwo stosowania tego leku podkreśla wielu autorów, chociaż farmakokinetyka, zależna od CYP2D6 i CYP3A4 wskazy-wałaby na możliwe istotne różnice w jego metabolizmie w naszej populacji [26]. Opisana metodyka jest zalecana do monitorowania terapii pomiarem stęże-Zakres liniowości (LOL) [ng/ml] 100 – 800Równanie y=0,031x - 0,4456R2 0,9967Granica wykrywalności (LOD) [ng/ml] 10Granica oznaczalności (LOQ) [ng/ml] 100PrecyzjaCV [%]100 ng/ml800 ng/ml 6,14,9Zmienność w czasie dniaCV [%]100 ng/ml800 ng/ml 11,15,1Zmienność pomiędzy dniamiCV [%]100 ng/ml800 ng/ml9,05,1Tabela IParametry walidacji metody oznaczania arypiprazolu w surowicy metodą HPLC-UV.Validation parameters of aripiprazole serum determination by HPLC-UV.nia arypiprazolu w surowicy; cechuje się odpowiednią czułością i selektywnością, umożliwia oznaczenie stężenia leku w ma-teriale biologicznym na poziomach terapeu-tycznych, także u pacjentów przyjmujących inne leki. Opracowanie metody, walidacja i oce-na jej przydatności w praktyce klinicznej stanowią etap wstępny pracy badawczej dotyczącej bezpieczeństwa i skuteczności terapii arypiprazolem. Planowane jest zba-danie korelacji pomiędzy dawką, stężeniem leku w surowicy oraz obserwowanym efek-tem klinicznym. W dalszej części podjęta zostanie próba wyznaczenia zakresu stężeń terapeutycznych arypiprazolu podczas dłu-gotrwałego leczenia. Piśmiennictwo1. Bhattacharjee J., El-Sayeh H.G.G.: Aripiprazole versus typical antipsychotic drugs for schizophrenia. The Cochrane Library, 2010.2. Caloro M., Lionetto L., Cuomo I. et al.: An improved simple LC-MS/MS method for the measurement of serum aripiprazole and it’s major metabolite. 2012, 62, 135. 3. Kirschbaum K. M., Muller M. J., Zernig G. et al.: Therapeutic monitoring of aripiprazole by HPLC with column-switching and spectrophotometric detection. Clin. Chem. 2005, 51, 1718. 4. Kirschbaum K. M., Uhr M., Holthoewer D. et al.: Pharmacokinetics of acute and sub-chronic aripi-prazole in P-glycoprotein deficient mice – Sci. Direct Neuropharmacol. 2010, 59, 474.5. Krzystanek M., Krupka-Matuszczyk I.: Severity of negative symptoms in schizophrenic patients treated with atypical neuroleptic – follow-up. Probl. Med. Rodz. 2008, 4, 63.6. Lancelin F., Djebrani K., Tabaouti K. et al.: Deve-lopment and validation of a high-performance liquid chromatography method using diode array detection for the simultaneous quantification of aripiprazole and dehydro-aripiprazole in human plasma. J. Chromatogr.B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2008, 867, 15.7. Laughren T.: ABILIFY (aripiprazole) Tablets. Otsuka Pharmaceutical Co, Ltd. 2006.8. Mallikaarjun S., Salazar D.E., Bramer S.L.: Phar-macokinetics, tolerability, and safety of aripiprazole following multiple oral dosing in normal healthy volunteers. J. Clin. Pharmacol. 2004, 44, 179.9. Musenga A., Saracino M. A., Spinelli D. et al.: Analysis of the recent antipsychotic aripiprazole in human plasma by capillary electrophoresis and high-performance liquid chromatography with diode array detection. Anal. Chim. Acta 2008, 612, 204.10. Ohno Y.: Therapeutic role of 5-HT1A receptors in the treatment of schizophrenia and parkinson’s diseas. CNS Neurosci. Therap. 2011, 17, 58.11. Pużyński S.: Postępy w psychiatrii w 2005 roku. Med. Prak. 2006, 2, 172.12. Seeman P.: All roads to schizophrenia lead to dopa-mine supersensitivity and elevated dopamine D2 high receptors. CNS Neurosci. Therap. 2011, 17, 118. 13. Shimokawa Y., Akiyama H., Kashiyama E. et al.: High performance liquid chromatographic methods for the determination of aripiprazole with ultraviolet detection in rat plasma and brain: application to the pharmacokinetic study. J. Chromatogr, B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2005, 821, 8.14. Travis M. J., Burns T., Dursun S. et al.: Aripiprazole in schizophrenia: consensus guidelines. Blackwell Publishing Ltd Int. J. Clin. Pract. 2005, 59, 485. 15. Ucok A., Gaebel W.: Side effects of atypical antipsychotics: a brief overview. World Psychiatry 2008, 7, 58.16. Woroń J., Grabski B., Siwek M.: Pharmacoepi-demiological and toxicological aspects of atypical neuroleptics usage. Przegl. Lek. 2011, 68, 47.

Application of HPLC-UV method for aripiprazole determination in serum

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Jagiellonian Univeristy Repository