横浜市立大学博士(理学)2024年度doctoral thesi

塚本　俊太郎

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Yokohama City University Repository / 横浜市立大学学術機関リポジトリ

様式第4号 ー 1学位論文審査の結果の要旨氏 名 塚本 俊太郎学 位の種類 博士（理学）学 位記番号 甲 第   号 ※論文博士は乙学位授与の日付 令和 年 月 日学位授与の要件 文部科学省令学位規則第4条第1項該当 ※論文博士は第 4 条第 2 項学 位論 文題目 Oxa-Michael-based divergent synthesis of artificial glutamate analogs 主指導教員 及川 雅人 教授論 文審査委員 （主査）本多 尚 教授（副査）篠崎 一英 教授（副査）島崎 智実 准教授（副査）横山 崇 教授論文内容の要旨イオンチャネル型グルタミン酸受容体(iGluR)は、中枢神経系神経細胞のシナプスに存在し、 興奮性神経伝達を担っている。iGluRは高次脳機能、 すなわち学習、記憶、痛みの伝達において中心的な役割を果たす。また、 うつやてんかん、 アルツハイマー病のような中枢神経系の疾患にも密接に関わっている。 したがってiGluRは高次脳機能の分子レベルでの解析や、 脳疾患創薬のター ゲットとして注目されてきた。iGluRを創薬標的とした 研究を進めるために有用なのが特異的なモジュレータ ーの開発である。 このようなモジュレータ ーは未だ全容が明らかになっていないiGluRのマシナリーの解明に役立つだけでなく、 創薬のシー ズとなることが多い。モジュレータ ーの条件としては「生理学的に3つ(AMPA型、 KA型、 NMDA型）に分類されているiGluRに対して高い選択性で特異的に作用すること」が挙げられる。 本 論文は、AMPA型iGluRに対して特異的に作用するモジュレーターの開発を目指し、 申請者が合成化学的に展開した研究をまとめたものである。申請者は、まずAMPA型iGluRのアンタゴニストとして開発されたIKM-159の構造を改変することによる新規モジュレータ ーの合成化学的開発を行った（第1章）。 IKM-159は、 KA型iGluRに対して共に強力なアゴニストとして働くカイニン酸とダイシハーベインを構造 的にハイブリッドさせて2008年に報告された。その後の生理学研究に2068７ ３ 25より IKM-159はAMPA型iGluRの中でもGluA2/GluA4に対してサブタイプ選択的に作用するアンタゴニストであることが明らかにされている。しかしながら、 IKM-159は生理学的にはアンタゴニスト作用を示すものの、そのメカニズムが不明であるという課題が残されている。IKM-159はGluA2二量体との複合体においてリガンド結合部位に作用することが結晶構造解析によって示されている。一方で、放射性リガンドを用いた結合阻害実験においてIKM-159はAMPA型iGluRに対して極めて弱い結合を示すにとどまっていた。以上の知見からIKM-159は生理的環境においてはiGluRのアロステリックサイトに作用すると考えられた。このことを調べるため、申請者はIKM-159の構造に光親和性基を導入することを計画した。 IKM-159は3つの環にグルタミン酸が縮合した特異な構造を有しているが、そのうち第3環であるC環が構造修飾に適していると考え、本研究では、 IKM-159が本来有する生理活性を損なわずに保持した類縁体の合成化学的開発に取り組むことにした。そのための方法論として、申請者が過去に報告した、 「ヘミアセタールからエノンヘのオキサマイケル反応」を活用することとした。モデル反応とは異なりここではメチルエステル中間体がその除去の際に副反応を引き起こすなどの問題が生じたものの、最終的に本研究では5種類の新規グルタミン酸関連化合物を合成することに成功した。さらに、本研究では反応の順序を入れ替える、すなわちオキサマイケル反応ののちにヘミアセタール化を行うことによって異なる骨格の創出にも成功した。合成に成功した6種の新規グルタミン酸類縁体をマウスの脳室内に投与する活性試験を行い、 TKM-50と名付けた化合物に抑制性の活性があることを見出した。以上のように、本研究においては当初の目的に掲げたC環部の構造修飾の実現に成功したものであるが、加えて骨格多様性の獲得を可能にする合成化学的な技術を概念の提案と実証をも行うに至った。申請者は引き続き、キラルなaーアミノ酸の化学合成に取り組んだ（第2章） 。これは一次代謝産物として自然界に広く存在し、ペプチドやタンパク質の構成成分でもある。自然界には二次代謝産物として極めて特殊な構造のキラルアミノ酸も存在し、その多くは特異的な生理作用を示す。こうした背景からaーアミノ酸を自在にキラル合成する技術の開発が進められてきた。申請者は第1章にて神経活性を有する新規なグルタミン酸類縁体TKM-50の開発に成功しており、このキラル合成にも適用が可能な化学合成法の開発を行うことにした。そしてこの目的のため、キラルアミンを用いたUgi多成分縮合反応の生成物を出発物質とした合成法を発案しその可能性を検討した。その結果、 morpholinone構造を経由した熱力学支配立体制御によるキラルなaーアミノ酸の化学合成法を開発することに成功した。そして申請者はその有用性についてN-Ac-tert-1 eucineのキラル合成を行って実証した。ここで申請者が開発した合成法は、第1章にて見出したTKM-50のキラル合成にも適用が可能であると考え、実際にその合成経路の発案にも生かされた。様式第4号ー2〔学位申請者塚本俊太郎〕論文審査結果の要旨本論文の審査は、塚本俊太郎氏の提出論文の内容、 2024年 12月 23日に開催された博士論文発表会、および 12月 26日に開催された口頭試問に基づき、 4名の審査委員（主査 ：本多尚教授、副査 ：篠崎一英教授、横山崇教授、島崎智実准教授）によって行われた。口頭試問は、塚本俊太郎氏による研究内容の発表に続き、審査員による本研究に関する専門の質疑、および理学一般と英語能力に関する質疑であった。本研究はグルタミン酸受容体(iGluR)に対して特異的に作用するIKM-159に着目し研究を発展させている。IKM-159が生理活性を発動するAMPA受容体の位置が未特定である こと から、申請者は7位にAMPA受容体と光で共有結合する基質部位を導入し、グルタミン酸類縁体とAMPA受容体が相互作用する位置を特定する研究計画を立案した。この研究を遂行するにあたり 7位に基質を導入した新規化合物の合成を行った。その際、試薬の順番を入れ替えることで複数の有益な誘導体が導けることを解明した。また、特に創薬分野で有用なエネンチオヒ゜ュアなa—アミノ酸の合成方法を確立した。専門に関する口頭試問：先行研究の内容について篠崎副査から結晶構造解析と放射性リガンドに関する質問があり、単結晶調整にAMPAが含まれていない。ラジオアクティブなAMPAをIKM-159が追い出せない。 と回答があり、この課題解決に取り組むためにPAL(photoaffinity labeling)を用いる研究計画が有益であることが説明された。また、 PALプローブが受容体のどこに結合するのかとの質問についてはアミド基に攻撃すると回答があった。研究計画に関して横山副査から7位周辺の隙間の大きさはシミュレーションできないかとの質問に対し、ドッキングシュミレーションなど行うのが好ましいが、本研究では行っていないとの回答があった。また、分子設計に関する質問には構造情報と合成技術を加味して計画を作成したと回答があった。島崎副査から受容体と結合することを前提に分子設計することについて質問があり 、分子設計には手がかりが必要であり、先行研究のIKM-159の知見を元に活性が失われる9位に置換基を導入しないなどのルールに則り分子設計を行ったことが説明された。分子構造決定の手法について横山副査から質問があり、多段階合成の各ステップでNMR等を用いて構造解析を行っている。そのため構造を誤るリスクは小さいと回答があった。合成実験に関して篠崎副査からヘミアセタール化とオキサマイケル反応の順番に関する質問があった。試薬（反応条件）を変えることで両者の順番が変わることが説明された。さらにオキサマイケル反応で観測される熱力学支配について質問があり、熱力学支配条件においては、出発物質と生成物の間に平衡がある。また、速度論支配の場合、中間体の活性化エネルギーが低いものが生成物につながっていくとの回答があった。触媒についての質問には、計算化学による分子設計を活用した触媒開発も行われているが、ランダムスクリーニングで探すのが一般的である。本研究でもオーソドックスな触媒を並列的に実験し適したものを選んでいるとの回答があった。また、スクリーニングで意外なものが良かったことも経験しているとのコメントもあった。本多主査からウギ反応で立体制御したアミノ酸合成手法をIKM系化合物にも適用できるのかという質問に対し、ウギ反応の生成物が引き続く分子内ディールスアルダー反応の基質となるが、その構造は複雑であり、それを容易に得る方法は、先行研究にはない。本研究で開発した手法で合成が可能になるという回答があった。DFT計算に関して本多主査から立体異性体間で3位の化学シフト値が大きく異なった理由が問われたが、アキシアルの方が低磁場に出る傾向があるが、それ以上は考えていなかったと回答があった。横山副査からDFT計算結果を盲目的に受け入れることについてコメントがあり、共同研究者の指導を受けながら行っているが、詳細は確認すると回答があった。研究の展開に関して島崎副査から質問があり、 IKM系化合物は、機能性ジペプチドを導入することによって医薬品に導くことができると回答があった。さらにプロセス研究と創薬研究について意見を問われ、プロセス化学の知識は実験条件の選択に役立ち、ウギ反応は多段階合成の段階数を減らすことのできる反応であるのでプロセス化学の省力化に役立つ。博士後期課程ではそれらの高い相乗効果に気づくことができたと回答があった。横山副査から2報目の論文投稿までに時間を要した理由を問われ、合成実験は時間を要する。週末だけでは時間がかかったと回答があった。2報目の論文の進捗については夏頃から自分で原稿作成に取り組んだことが述べられた。本多主査から外国語の能力に関する質問があり、上司がドイツ人で毎週2時間英語でディスカッションしている。また業務委託先も海外が多いので、外国人とのコミュニケーションは日々行っているとの回答があった。理学関連知識に関する質問として篠崎副査から不斉化合物の分析に用いる測定方法とその原理について質問があり、旋光度測定とキラルカラムを用いたHPLCの説明がなされた。さらに、実験を行う際の注意点に関しては、旋光度測定では温度、濃度、溶媒をそろえることと回答があった。横山副査から質量分析装置に関する質問があり、オービートラップ型の説明がされた。本多主査から、立体構造を決定したNOESYについて質問があり、空間的な距離でエネルギー移動（スピン緩和）が起こることを用いているとの説明があった。島崎副査からDFT計算について質問があり、 MM2法と比較しながら説明がなされた。また、島崎副査から理学博士としてどういった研究者になるのか質問があり、スキルアップを望んで博士後期課程に入学したが、海外ではPhDを持っていると一流の研究者として認めてもらいやすいメリットはある。今後は視野を幅広く持って第一線でやっていける研究者になりたい。また自分の軸は有機化学なので、それをしつかり固めてそこから派生する分析化学、製剤などにも携わっていきたいと意気込みが述べられた。最終判断として、研究の立案とそれを遂行する能力に優れていることが伝わる論文審査会であった。計算化学は道具として活用している面は若干感じられたが、実験に用いたNMRや旋光度測定等の手法にも精通しており、その基礎原理を理解しようとする姿勢も評価できる。また論文投稿、レフェリ ーとのやり取り、受理掲載まで自分で行っており、 日常的に英語で会社業務のコミュニケーションをとっている ことから、博士の学位を授与するに十分相応しい能力を有していると判定した。

Oxa-Michael-based divergent synthesis of artificial glutamate analogs

https://ycu.repo.nii.ac.jp/record/2003502/files/%E7%94%9F%E5%91%BD%E3%83%8A%E3%83%8E%E3%82%B7%E3%82%B9%E3%83%86%E3%83%A0%E7%A7%91%E5%AD%A6%E7%A0%94%E7%A9%B6%E7%A7%91_%E5%A1%9A%E6%9C%AC%E4%BF%8A%E5%A4%AA%E9%83%8E_%E7%94%B22068%28%E5%AF%A9%E6%9F%BB%E7%B5%90%E6%9E%9C%E8%A6%81%E6%97%A8%29.pdf

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