京都大学新制・課程博士博士(薬科学)甲第25590号薬科博第193号新制||薬科||22(附属図書館)京都大学大学院薬学研究科医薬創成情報科学専攻(主査)教授 大野 浩章, 教授 掛谷 秀昭, 教授 二木 史朗学位規則第4条第1項該当Doctor of Pharmaceutical SciencesKyoto UniversityDFA

Iwamoto, Naoya

English

Kyoto University Research Information Repository

                                       京都大学    博  士（薬科学）    氏  名    岩本  直也   論文題目  Synthesis and Functional Characterization of Protein Domains for Development of Mirror-Image Therapeutics （ 鏡 像 分 子 か ら な る 治 療 薬 の 開 発 に 向 け た タ ン パ ク 質 ド メ イ ン の合成と機能評価）                       （論文内容の要旨）                               タ ン パ ク 質 ド メ イ ン は 特 定 の 機 能 を 発 現 す る 最 小 の 構 造 単 位 で あ り 、 タ ンパ ク 質 の 構 造 や 機 能 を 理 解 す る た め の 解 析 対 象 で あ る と と も に 、 新 た な 機 能性 タ ン パ ク 質 の 創 出 に 向 け た 安 定 な 足 場 骨 格 と し て も 利 用 さ れ て い る 。 全 配列が D-アミノ酸から構成される鏡像タンパク質からなるドメイン構造を取得で き れ ば 、 天 然 タ ン パ ク 質 と 鏡 映 し の 生 物 活 性 ・ 機 能 を 活 用 す る た め の 魅 力的 な 分 子 ツ ー ル と な り う る 。 著 者 は 、 化 学 合 成 に よ っ て の み 取 得 可 能 な 鏡 像タ ン パ ク 質 ド メ イ ン の 創 薬 応 用 に 向 け て 、 タ ン パ ク 質 ド メ イ ン に 由 来 す る 標的分子・抗体様分子を対象とした合成化学的検討を行った。  第 一 章 ： 鏡 像 ス ク リ ー ニ ン グ の 標 的 と し て 利 用 可 能 な タ ン パ ク 質 ド メ イ ン の合成研究  生 体 内 の 標 的 に 結 合 す る 鏡 像 分 子 の 探 索 に 向 け て 、 鏡 像 ス ク リ ー ニ ン グ に適用可能な鏡像標的タンパク質を取得するべく、2 つのタンパク質ドメインの化学合成ならびに機能評価を行った。  第一章第一節：溶解性向上タグを用いた TIGIT 細胞外ドメインの合成研究  免疫チェックポイント阻害剤探索の標的分子である TIGIT（T cell immunoreceptor with immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain）細胞外ドメイン（ 120 残基： TIGIT(22–141)）の合成検討を行った。 4 つのペプチドセグメントを原料として、Trt-K10 溶解タグを用いて高疎水性中間体の溶解性を適宜改善することにより、 TIGIT 細胞外ドメインの化学合成法を確立した。得られた化学合成 TIGIT(22–141)が、 CD155 に対する結合活性を示すことを確認した。  第一章第二節：ヒト血清アルブミンドメイン III の化学合成と鏡像タンパク質を用いたサイト II 依存的な分子認識の解析  薬 物 の 体 内 動 態 の 改 善 に 利 用 可 能 な ア ル ブ ミ ン 結 合 性 鏡 像 分 子 の 開 発 を 目指して、ヒト血清アルブミン（ HSA）ドメイン III（ 206 残基： HSA(380–585)）の化学合成を検討した。 7 つのペプチドセグメントを順次連結することにより、HSA ドメイン III 及びその鏡像体を化学合成した。HSA ドメイン III 中の薬物結合 サ イ ト II の リ ガ ン ド 結 合 能 お よ び エ ス テ ラ ー ゼ 活 性 に 基 づ き 、 化 学 合 成HSA(380–585)が有する機能の対称性について確認した。   第二章：機能性鏡像タンパク質の創出に向けた鏡像モノボディ改変体の開発  鏡 像 タ ン パ ク 質 は 、 生 体 内 安 定 性 に 優 れ 免 疫 原 性 を 軽 減 し た 新 規 創 薬 ス キャ フ ォ ー ル ド と な る こ と が 期 待 さ れ て い る 。 著 者 は 、 生 体 内 標 的 に 結 合 可 能な鏡像タンパク質の創製に向けて、ヒトフィブロネクチン III 型ドメインに由来 す る 抗 体 様 分 子 モ ノ ボ デ ィ に 着 目 し た 。 モ ノ ボ デ ィ は 、 ド メ イ ン が 形 成 する 安 定 な 基 本 骨 格 上 に 抗 原 認 識 部 位 と な る 複 数 の 可 変 領 域 を 配 置 し て お り 、可 変 領 域 の 配 列 に 応 じ て 様 々 な 標 的 分 子 に 結 合 す る こ と が で き る 。 著 者 は 、機 能 性 鏡 像 モ ノ ボ デ ィ の 取 得 に 向 け て 、 効 率 的 な 化 学 合 成 、 な ら び に 、 機 能化を目的とした化学修飾の基盤技術の開発を検討することとした。  モノボディ（約 100 残基）の 基本骨格中に 2 つの Cys 置換を導入した改変体を設計し、導入した Cys を足がかりとした短工程・高 効率な化学合成法を確立した。モノボディの配列中への Cys 置換は生物活性に影響を与えず、鏡像モノボ デ ィ の 免 疫 原 性 が 天 然 モ ノ ボ デ ィ と 比 べ て 著 し く 低 い こ と を 確 認 し た 。 これ ら の 結 果 か ら 、 鏡 像 モ ノ ボ デ ィ 改 変 体 が 有 望 な 創 薬 ス キ ャ フ ォ ー ル ド と なることが示唆された。  モ ノ ボ デ ィ 改 変 体 の さ ら な る 変 換 ・ 修 飾 に よ り 生 物 活 性 ・ 構 造 安 定 性 を 調節 ・ 向 上 さ せ る こ と が 可 能 で あ る と 考 え 、 モ ノ ボ デ ィ 改 変 体 の 基 本 骨 格 を 対象とした構造展開を行った。配列中に導入する Cys 置換の位置を変更した複数の改変体を設計・合成するとともに、 Cys からの化学変換・架橋リンカーの 導入 を 行 う こ と で 種 々 の モ ノ ボ デ ィ 誘 導 体 を 取 得 し た 。 モ ノ ボ デ ィ 誘 導 体 を 網羅 的 に 機 能 評 価 に 付 す こ と に よ り 、 熱 安 定 性 と 結 合 親 和 性 に 優 れ た モ ノ ボ ディ 誘 導 体 の 基 本 骨 格 を 見 出 し た 。 同 様 の 基 本 骨 格 を 有 す る 鏡 像 モ ノ ボ デ ィ を化学合成し、高い熱安定性・標的結合能が維持されることを確認した。  以 上 の タ ン パ ク 質 ド メ イ ン を 対 象 と し た 研 究 を 通 し て 、 鏡 像 空 間 か ら の 医薬 シ ー ズ の 探 索 に 利 用 可 能 な 複 数 の 分 子 プ ロ ー ブ の 供 給 を 可 能 と す る と と もに 、 ド メ イ ン 構 造 か ら な る 鏡 像 タ ン パ ク 質 の 創 薬 ス キ ャ フ ォ ー ル ド と し て の有用性を明らかにした。    （続紙  ２  ）                            （論文審査の結果の要旨）  本博士論文は、鏡像タンパク質ドメインの合成と活性評価、ならびに医薬品探索のための応用について述べている。近年、鏡像タンパク質は創薬モダリティとして注目を集めており、生物活性を有する鏡像タンパク質を見出すためのスクリーニング研究が活発に行われるようになっている。著者は本博士論文研究において、特定の機能を有する最小単位であるタンパク質ドメインに着目し、化学合成のみによって取得可能な鏡像タンパク質ドメインに由来する標的分子および抗体様分子を対象とした化学的研究を実施した。  第一章第一節においては、免疫チェックポイント阻害剤探索の標的分子として知られる TIGIT 細胞外ドメイン（ 120 残基）の化学合成法の開発研究について述べている。本ドメインは、ペプチドフラグメントの物性が極めて悪いことに加え、全長タンパク質のフォールディングが困難を極めることがすでに判明していた。著者は、合成経路に抜本的な改良を加えることでこれらの問題点を解決し、TIGIT細胞外ドメインの化学合成に成功した。さらに、本化学合成 TIGIT 細胞外ドメインが CD155 に対して結合活性を有することを確認した。  第一章第二節では、鏡像ヒト血清アルブミン（ HSA）ドメイン I I I（ 206 残基）の化学合成と分子認識に関する研究について述べている。 HSA は薬物の体内動態の改善に広く利用されているが、 HSA に対して結合活性を有する鏡像タンパク質は知られていない。著者はそのスクリーニングを実施するための基礎的研究として、HSA ドメイン I I I 及びその鏡像体の化学合成を実施し、得られた化学合成ドメインが、期待するリガンド結合能とエステラーゼ活性を有することを示した。  第二章においては、低免疫原性モノボディ改変体のデザインと化学合成について述べている。著者はヒトフィブロネクチン I I I 型ドメインに由来する抗体様分子モノボディ（約 100 残基）に着目し、モノボディの基本骨格中に 2 つの Cys 置換を導入した改変体の短工程・高効率な化学合成法を確立した。さらに、モノボディの配列中への Cys 置換は生物活性に影響を与えないこと、および鏡像モノボディの免疫原性が天然モノボディと比べて著しく低いことを確認した。  以上の研究成果は、鏡像タンパク質ドメインの化学合成法を確立しただけでなく、鏡像タンパク質ドメインに由来する標的分子・抗体様分子の創薬応用を大きく推進するものであり、本論文を博士（薬科学）の学位論文として価値あるものと認める。また、令和６年８月２日、論文内容とそれに関連した事項について試問を行った結果、合格と認めた。   要旨公表可能日： 2024 年 9 月 24 日以降    

鏡像分子からなる治療薬の開発に向けたタンパク質ドメインの合成と機能評価

https://repository.kulib.kyoto-u.ac.jp/dspace/bitstream/2433/292797/2/yykkk00193.pdf

鏡像分子からなる治療薬の開発に向けたタンパク質ドメインの合成と機能評価

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Kyoto University Research Information Repository