Beer, Martin

Depner, Klaus Robert

Hoffmann, Bernd

Schirrmeier, Horst

German

OA OpenAgrar repository

1Entwicklung und Validierung vonmultiplex real-time RT-PCR assays inder VirusdiagnostikBernd Hoffmann, Klaus R. Depner, HorstSchirrmeier & Martin BeerFriedrich-Loeffler-InstitutGreifswald-Insel RiemsVorteile der real-time PCR• Sehr sensitiv, da meistens sehr kleine Fragmenteamplifiziert werden.• Zuwachs an Spezifität, wenn die Detektion überSonden erfolgt.• Schnell, da Amplifikation und Detektion gleichzeitigablaufen.• Deutlich verminderte Kreuzkontaminations-gefahr, dakein Öffnen der PCR-Reaktions-gefäße nach derAmplifikation notwendig.• Quantifizierung von Nukleinsäuremengen möglich.2Multiplex real-time PCR• Einsatz von speziellen Quenchern (Dark Quencher, Black HoleQuencher)• Gleichzeitige Messung von bis zu 4 differentenFluoreszenzfarbstoffen• FAM 1.Zielsequenz• HEX interne Kontrolle• ROX/Texas Red Normalisierung/3.Zielsequenz• Cy5 2.ZielsequenzDifferenzierung von Amplifikaten auf Basis vonunterschiedlich Fluoreszenz-markierten SondenEmissionROX/Texas Red591/615 nmHEX556 nmFAM517 nmWellenlängeCy5670 nmAufgabe einer Interne Kontrolle (IC)Überprüfung der Funktion und Effektivität derDNA/RNA-Isolierung und/oder der PCR/RT-PCR fürjede einzelne aufgearbeitete Probe oder Probenpool3Arten von internen RNA-Kontrollen (1)Ø  Nutzung von interner zellulärer RNA: „housekeepinggenes“- Verifizierung der Zelllyse- nur bedingt anwendbar in zellfreien Proben- Quantität sehr variabel- relative QuantifizierungØ  Zugabe von externer RNA2.1. Natürlich vorkommende RNA (z.B. heterologe virale RNA,mRNA)- Verifizierung der Virionlyse- Infektions- und Kontaminationsrisiko- Arbeitsintensiv und teuerArten von internen Kontrollen (2)2.2. In vitro transkribierte RNA- N: kein Nachweis der Zell- bzw VirionlyseØHomologes IC-System: Zielgen- und IC-Amplifikation durch identischePrimer, Differenzierung über spezifische Sonden- IC-RNA muss für jede Anwendung neu konstruiert werden- Sensitivität des duplex RT-PCR-assays wird durch Co-Amplifikation eines relativ großen IC-Fragments erreichtØHeterologes IC-System: Komplett eigene Primer und Sonde- identische IC-RNA ist in unterschiedlichen assays einsetzbar- Sensitivität des duplex RT-PCR-assays wird durch Co-Amplifikation eines relativ großen IC-Fragments und des Einsatzes von limitierten IC-Primern erreicht 4Herstellung einer heterologen, universelleinsetzbaren, internen Kontrolle722 bpEGFP-Gen-part. • PCR             2. Klonierung 3. In vitroTranskription722 bpinterne Kontroll-RNApGEM-EGFP2 interne Kontroll-DNAEGFP-Gen-part HEXP15-FP2-RP14-F P13-F P12-F P11-F P1-F  P10-RAmplifikation der in vitro IC-RNAWell Well Name fragment size (bp) CtA4 EGFP_1-2 132 25,38B4 EGFP_1-10 177 24,6C4 EGFP_11-2 232 25,57D4 EGFP_11-10 277 25,64E4 EGFP_12-2 329 26,71F4 EGFP_12-10 374 26,74G4 EGFP_13-2 442 28,38H4 EGFP_13-10 487 28,61A5 EGFP_14-2 542 29,79B5 EGFP_14-10 587 29,87C5 EGFP_15-2 667 32,48D5 EGFP_15-10 712 32,84E5 NPC No Ct1,0 kbp0,5 kbp0,1 kbp5Stabilität der internen Kontrolle (IC)Well Name CtIC-1x 25,08IC-10x 25,05IC-20x 25,59IC-40x 25,65IC37-3 26,1IC37-7 26,81IC37-12 27,49Ø Frier-/Tauzyklen(1x , 10x , 20x , 40x)Ø Inkubation bei 37°C (3d , 7d , 12d)Entwicklung von multiplex real-time RT-PCRassays für die RoutinediagnostikØ Entwicklung und Etablierung von optimierten single assaysØ Co-Amplifikation und Detektion des Zielgens (FAM) und der IC(HEX)-duplex assayüAmplifikation von ca. 10 000 Kopien-IC/well (TC 27-30)üNutzung von limitierten Primermengen für die Amplifikation derICüAuswahl einer geeigneten IC-Amplifikatlänge für die Co-Amplifikation mit der ZielsequenzZiel: Sensitivität single assay = Sensitivität multiplex assay6Warum multiplex real-time RT-PCR?Deutlich mehr Sicherheit bei der Funktions-kontrolle derNukleinsäureextraktion, RT und PCRØNachweis von Zielgenom bei gleichzeitiger Co-Amplifizierungder ICØKein signifikanter Sensitivitätsverlust des multiplex assays imVergleich zum single assayMehr Informationen zur Probe ohne signifikanteErhöhung der Kosten/BearbeitungszeitCSFV real-time RT-PCR-Kenndaten des single assay-Copies/well 109     107         105    103      101NTC• Amplifikation eines 93 bp Fragments aus der 5`-NTR• Analytische Sensitivität: <10 Kopien/Well• Sensitivität im Vergleich zur VI:             0,1TCID50/RT-PCR• CSFV-spezifisch• Nicht-infektiöse positive Kontrolle (Standards)7CSFV real-time RT-PCR-Sensitivitätsvergleich single/multiplex assay-CSF-System 1 (FAM)Internal control (HEX)Rot- ohne IC Co-AmplifikationGrau- mit IC Co-AmplifikationØ Keine Differenz zwischen singleund multiplex assay.Real-time PCR assays am FLI–Insel Riems935`NTREigenentwicklungCSFVca. 2005`NTREigenentwicklungPanpesti/BVDV1823D-Genmodif. nach Rasmussen et al.(2003)FMDV250VP72-Gennach King et al. (2003)ASFV101M-Gennach Spackman et al. (2002)AIV65/84gD-/gE-GenEigenentwicklungBHV-1Single real-time PCR-Systeme84/645`NTR/NS2aEigenentwicklungWNFV105(US)/96(EU)ORF 7modif. nach Egli et al. (2001)PRRSV131Tegument proteingenenach Hüssy et al. (2001)OvHV-2105NP-Gennach Guillaume et al. (2004)Nipah VirusTargetsequenzNDV, SVDV, Hendra VirusReal-time PCR-Systeme in PlanungEtablierte multiplex real-time PCR-SystemeTargetlänge (bp)Primer- & SondenableitungVirus

Entwicklung und Validierung von multiplex real-time RT-PCR assays in der Virusdiagnostik

https://www.openagrar.de/servlets/MCRFileNodeServlet/Document_derivate_00009758/SD2004AVID05.pdf

Entwicklung und Validierung von multiplex real-time RT-PCR assays in der Virusdiagnostik

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

OA OpenAgrar repository