La necesidad de optimización de una técnica que permita la visualización de cromosomas mitóticos surgió de resultados poco satisfactorios de otros protocolos de coloración ensayados, tales como técnicas de tinción con ácido acético 45% para observación con microscopio de contraste de fases, hematoxilina acética, orceína acética 2% y carmín acético 2% (sin mordiente). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una técnica para la observación reiterada de cromosomas mitóticos en raicillas de especies del género Passiflora.Fil: Pereira S., Claudia. Universidad Nacional de Asuncion; Paraguay;Fil: Honfi, Ana Isabel. Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Cs.exactas Quimicas y Naturales. Laboratorio de Citogenetica Vegetal; Argentina;Fil: Deginani, Norma Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Botánica Darwinion (i); Argentina;Fil: Ferrucci, Maria Silvia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Nordeste. Instituto de Botánica del Nordeste (i); Argentina

Deginani, Norma Beatriz

Ferrucci, María Silvia

Honfi, Ana Isabel

Pereira S., Claudia

LAReferencia - Red Federada de Repositorios Institucionales de Publicaciones Científicas Latinoamericanas

Vol. 5 – 2013 ISSN 2077-8430                                                                 Passiflora edulis Sims.      Laboratorio de Análisis de Recursos Vegetales Departamento de Biología Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad Nacional de Asunción  Steviana       Steviana, Vol. 5, 2013, pp. 69-75  Optimización de una técnica para la observación de cromosomas mitóticos de especies de Passiflora L.  Claudia Pereira S.1, Ana I. Honfi2, Norma Deginani3, María S. Ferrucci4   1Laboratorio de Análisis de Recursos Vegetales. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales – Universidad Nacional de Asunción, Paraguay. 2Laboratorio de Citogenética Vegetal, Programa de Estudios Florísticos y Genética Vegetal, Instituto de Biología Subtropical (IBS, UNaM CONICET), Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales - Universidad Nacional de Misiones, Argentina. 3Instituto de Botánica Darwinion, Labardén 200, Casilla de Correo 22, B1642HYD, San Isidro, Argentina. 4Instituto de Botánica del Nordeste (UNNE-CONICET), C.C. 209, 3400 Corrientes, Argentina. E mail del autor: clauddinha_7@hotmail.com  Optimización de una técnica para la observación de cromosomas mitóticos de especies de Passiflora L. La necesidad de optimización de una técnica que permita la visualización de cromosomas mitóticos surgió de resultados poco satisfactorios de otros protocolos de coloración ensayados, tales como técnicas de tinción con ácido acético 45% para observación con microscopio de contraste de fases, hematoxilina acética, orceína acética 2% y carmín acético 2% (sin mordiente). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una técnica para la observación reiterada de cromosomas mitóticos en raicillas de especies del género Passiflora.  Palabras claves: Passiflora – mitosis - cromosomas  An improved technique for the observation of mitotic chromosomes in Passiflora L. species. The need for the optimization a technique that allows the visualization of mitotic chromosomes emerged from unsatisfactory results with other  tested staining protocols, such as staining techniques with acetic acid 45% for observation with the phase contrast microscope, acetic hematoxylin, acetorcein 2%, and acetic carmine 2% (without mordant). The purpose of this work was to develop a feasible technique for repeated observation of mitotic chromosomes in rootlets of species of the genus Passiflora. Key words: Passiflora – mitosis - chromosomes  INTRODUCCIÓN  La familia Passifloraceae está dividida en dos tribus Paropsieae e Passiflorieae; compuesta actualmente por 18 géneros (Deginani, 1999, 2001; Pérez-Cortez et al. 2009). Passiflora L. es uno de los más grandes de la familia, con aproximadamente 530 especies. Las especies de Passiflora constituyen una parte visible de la flora neotropical, presentan una amplia distribución, desde el sur de Argentina hasta el sur de Estados Unidos (Hansen et al. 2006), sin embargo es en América del Sur donde ocurre la mayor concentración de especies, particularmente en la zona andina (Deginani, 2001). La información cariológica de las especies de Passiflora es de interés para el análisis evolutivo y el mejoramiento genético, como también  para caracterizar las colecciones de germoplasma y promover su conservación a largo plazo. Aproximadamente el 30% de las especies de Passiflora posee información sobre el número cromosómico (Soares-Scott et al.                Steviana, Vol. 5. Pereira et al: Optimización de una técnica para la observación de cromosomas mitóticos de especies de Passiflora L.       70     2005), el género registra especies diploides y poliploides. La observación de cromosomas mitóticos en la mayoría de las plantas se consigue con la aplicación de métodos y protocolos convencionales muy generalizados. De acuerdo al material a estudiar, se toman decisiones respecto del tejido que se utilizará para conseguir numerosas divisiones mitóticas y cuál será el método más adecuado para visualizar los cromosomas; se destaca que la colecta y preparación del material es fundamental. En plantas, la mayor cantidad de células  mitóticas se encuentra generalmente en el tejido meristemático, tejido encontrado en diferentes órganos vegetales que se caracteriza por presentar células indiferenciadas. Para el análisis cromosómico mitótico el meristema más adecuado es el radical, debido principalmente al volumen histológico y porque absorben más fácilmente las soluciones externas, aspecto muy importante cuando se usan anti-mitóticos. La obtención de raíces para el análisis cromosómico puede realizarse a partir de semillas, bulbos, tallos y plantas adultas cultivadas en macetas (Honfi et al. 1990; Hojsgaard et al. 2009; Daviña et al. 2009). Si no se cuenta con raíces apropiadas, pueden ser utilizados otros meristemas, como por ejemplo, la parte más joven y central de los brotes foliares en crecimiento, anteras y paredes del ovario de los botones florales menores y varios otros órganos de crecimiento activo (zarcillos, pétalos, embriones, óvulos, etc.) (Daviña com. pers. 2013). Otro aspecto a tener en cuenta es el horario en el que se seleccionan las raicillas, dado que en la mayoría de las especies, los horarios matutinos dan buenos resultados. En Passiflora, los estudios de cromosomas mitóticos son relativamente pocos y diversos son los números básicos propuestos para las especies conocidas del género, desde x = 3 ó 6 (Storey, 1950), hasta n = 12  y n = 6 (De Melo and Guerra, 2003). Además, en el género Passiflora, es importante distinguir intra-específicamente el nivel de ploidía porque se han encontrado diversos citotipos dentro de un mismo taxón. Dichas series poliploides intraespecíficas expresadas en diversos citotipos, se han encontrado por ejemplo, en P. misera Kunth con 2n = 12, 36 (2x, 4x); P. suberosa L. con 2n = 12, 24, 36 (2x, 4x, 6x) (De Melo et al. 2001). El objetivo del presente trabajo es optimizar un protocolo citogenético para la observación de cromosomas mitóticos que resulte repetible en especies del género Passiflora.  METODOLOGÍA   Material de estudio  Los materiales estudiados fueron raicillas de Passiflora edulis Sims, provenientes del Distrito de Félix Pérez Cardozo, Dpto. de Guairá - Paraguay; ubicado a 25º 45’ 00” S y 56º 25’ 60” O (Pereira 26, 32, 33, 34, 35). Los ejemplares testigo se colectaron con duplicados y quedaron depositados en el Herbario de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad Nacional de Asunción (FACEN).                 Steviana, Vol. 5. Pereira et al: Optimización de una técnica para la observación de cromosomas mitóticos de especies de Passiflora L.       71          Figura 1: Passiflora edulis Sims. A.- Hábito. B.- Flor. C.- Fruto inmaduro. D.- Porción de fruto       con las semillas  Ensayo  Los preparados se realizaron a partir de raicillas obtenidas de semillas puestas a germinar en oscuridad durante al menos 2 semanas. Las raicillas fueron pretratadas con solución saturada de 8-hidroxiquinoleína 0,002 M (2mM) (Tjio and Levan, 1950) durante 24 hs en la heladera. La finalidad del pretratamiento fue obtener la acumulación de profases tardías y metafases mitóticas, buena separación de los cromosomas, y permitir la visualización de las constricciones primarias y secundarias. Luego fueron fijadas en etanol absoluto: ácido acético glacial en proporción 3:1 (mezcla de Farmer) a temperatura ambiente por una hora y conservadas a -20ºC hasta su utilización. Posteriormente, se realizaron  tres lavados sucesivos de 5 minutos cada uno en agua destilada, las raicillas fueron escurridas en papel de filtro, posteriormente hidrolizadas con HCl 1N por 10 minutos a 60ºC y se colorearon con Reactivo de Schiff (Feulgen and Rossenbeck, 1924), durante 24hs, a oscuridad y a 4ºC. El meristema coloreado fue macerado en carmín                Steviana, Vol. 5. Pereira et al: Optimización de una técnica para la observación de cromosomas mitóticos de especies de Passiflora L.       72     acético 2% (Belling, 1926, 1928) y se utilizó un estilete oxidado como mordiente. Los preparados se hicieron permanentes con solución de Terpentina de Venecia y para ello se agregó una gota de dicha solución en uno de los bordes del cubreobjeto y se facilitó su difusión colocando en el lado opuesto un triángulo de papel de filtro para absorber el colorante. Se dejó secar el medio de montaje por 48 horas o más. También se ensayaron diversos tipos de coloración, entre ellos se aplicaron tinción con hematoxilina (Saez, 1960), Giemsa (Guerra, 1986) y orceína acética, sin resultados convenientes.  Fotografías  Las microfotografías fueron tomadas con cámara digital MOTICAM (2006), incorporada al microscopio óptico marca OLYMPUS serie CX31 con ocular de 100x.  RESULTADOS Y DISCUSIÓN   La obtención de raicillas apropiadas, es decir que dispongan de al menos 1 cm de longitud y un meristema de buen tamaño ha sido uno de los pasos más críticos. Entre los inconvenientes que se presentaron, podemos mencionar frutos con insuficiente cantidad de semillas, la falta de germinación de las mismas y la presencia de meristemas muy pequeños. Los preparados mitóticos obtenidos con la técnica propuesta, permitieron la visualización nítida y esparcida de los cromosomas (Fig. 2 A–C). El número cromosómico observado para esta especie es 2n = 18, confirmando el número cromosómico reportado por Janaki Ammal (1945), Storey (1950) y Guerra (1986). Claramente se identificaron la presencia de constricciones secundarias o satélite en el par de cromosomas más pequeño (Fig. 2 A). En especies de Passiflora, existen  variaciones en la localización y en el número de constricciones secundarias. Por ejemplo, en P. edulis f. flavicarpa, Oliveira e Coleman (1996) encontraron  una constricción secundaria en el cromosoma 8; Mayeda (1997) y Cuco et al. (2003) registraron dos pares de cromosomas satelitados localizados en los pares 8 y 9; Soares-Scott (1998) en los cromosomas 4 y 7; Praça et al. (2008) en los cromosomas 1, 2, 7 y 8; y Penha (2012) un par de constricciones secundarias en los cromosomas 7 y 8. Se observa poca coincidencia respecto de la nomenclatura cromosómica utilizada  para describir los cariotipos, por lo tanto, es posible que se trate de los mismos cromosomas en más de uno de los casos citados.                 Steviana, Vol. 5. Pereira et al: Optimización de una técnica para la observación de cromosomas mitóticos de especies de Passiflora L.       73      Figura 2: Cromosomas en mitosis de Passiflora edulis Sims. A.- B.- Metafase, 2n = 18. La flecha indica la constricción secundaria y el satélite. La barra indica 10 µm.   CONCLUSIONES   El protocolo ensayado permitió la visualización clara de los cromosomas mitóticos, este ha sido probado en reiteradas ocasiones y es recomendable su aplicación para otras especies del género. Su aplicación ayudará a disponer información citológica integral de Passiflora, contribuirá a comprender la biología evolutiva del género, especialmente, respecto a la evolución cromosómica que han tenido sus especies. Las procedencias analizadas en el presente trabajo no presentaron variaciones en el numero cromosómico, 2n = 18. La existencia de diversos números básicos ha sido una herramienta que algunos autores han usado para agrupar especies y caracterizar secciones del género, sin embargo, aun los datos son insuficientes para proponer la direccionalidad de los cambios cromosómicos disploides que han tenido lugar.  REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS  Belling, J. 1926. The iron-acetocarmine method of fixing and staining chromosomes. Biol. Bull. 50: 160-162. Belling, J. 1928. 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Pereira et al: Optimización de una técnica para la observación de cromosomas mitóticos de especies de Passiflora L.       75     Faleiro, F.G.; Junqueira, N.T.V.; Braga, M.F. (Ed.).  Maracujá: germoplasma e melhoramento genético. Embrapa Cerrados, Planaltina. Pp. 213-240. Storey, W.B. 1950. Chromosome numbers of some species of Passiflora occurring in Hawaii. Pacific Sci. (US). 4: 7-42. Tjio, J.H. and Levan, A. 1950. The use of oxyquinoline in chromosome analysis. Anal. Estac. Exp. Aula, 2: 21-64.          

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