Cserép, Balázs Gergely

ELTE Digital Institutional Repository (EDIT)

Bioortogonális jelzésre alkalmas kémiai hírvivők és fluoreszcens jelzővegyületek szintézise és alkalmazása doktori értekezés tézisei  Cserép Balázs Gergely okleveles vegyész  Témavezető: Dr. Kele Péter tudományos főmunkatárs  Kémia Doktori Iskola iskolavezető: Dr. Inzelt György egyetemi tanár  Szintetikus kémia, anyagtudomány, biomolekuláris kémia program programvezető: Dr. Perczel András egyetemi tanár    Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2015. 2 1. Bevezetés  A fehérjék, oligonukleotidok és más biopolimerek fluoreszcens módosítására alkalmas módszerek kulcsfontosságúak a modern biotechnológiai, gyógyszerkémiai és molekuláris biológiai kutatásokban.1,2 A különböző molekulák, vagy akár egész sejtek in vitro vagy in vivo, fluoreszcens jelölésének legfontosabb előnyei a sejten belüli pozícionálást lehetővé tevő jó tér- és időbeli felbontóképesség, valamint az igen érzékeny, akár egyetlen molekula kimutatására is alkalmas, relatíve olcsó detektálhatóság.3,4 Több fluorofór együttes, energia-transzfer rendszerekben történő felhasználásával kölcsönhatások, ezáltal dinamikusan változó folyamatok vizsgálata is lehetséges. A legsokoldalúbb felhasználhatósági lehetőséggel a kis, szintetikus jelzővegyületek rendelkeznek, ugyanis reaktivitásuk, fotofizikai és oldhatósági paramétereik szintetikusan hangolhatóak és a genomban nem direkt módon kódolt molekulák tanulmányozására is alkalmazhatóak. Jelentőségüket jól mutatja, hogy 2014-ben, részben ilyen mesterséges jelzővegyületeknek köszönhetően, a szuperfelbontású mikroszkópia terén elért fejlesztésekért ítélték oda a kémiai Nobel-díjat.5 A biomolekulák natív környezetben történő, kis, szintetikus vegyületekkel való fluoreszcens módosításának leghatékonyabb módszerei az ún. bioortogonális ligációkon alapuló eljárások,6 melyek során két biokompatibilis, nem-természetes funkciós csoport fiziológiás körülmények között lejátszódó nagy hatékonyságú, gyors és egymásra nézve szelektív (ortogonális) reakciója révén stabil kovalens kötés jön létre biokompatibilis termékeket eredményezve.7 A jelenleg ismert bioortogonális átalakítások közül a legelterjedtebbek és reakciósebességüket figyelembe véve leggyorsabbnak tekinthetőek az azidok és alkinok közti 1,3-dipoláris cikloaddíciós, valamint a tetrazinok feszült gyűrűs alkinokkal / alkénekkel való Diels-Alder reakciói.6,8 Az ilyen jelölési technikák kétlépéses, szekvenciális eljárást követnek, melynek során a célvegyületet először egy bioortogonális funkciós csoporttal ellátott hírvivő molekulával (chemical reporter) módosítjuk, majd az így kapott, mesterségesen funkcionalizált specieszeket egy második lépésben reagáltatjuk a komplementer bioortogonális csoporttal ellátott jelzővegyülettel.9 A kémiai hírvivő beépítésére több módszer is kínálkozik; fehérjék esetében lehetőség van in vitro C- vagy N-terminálison való előzetes módosításra, ritka aminosavakon (Cys, Tyr) történő bevitelre, vagy mesterséges aminosavak genetikai kódolására.10 A cisztein, mint az egyik legritkább aminosav kiváló lehetőséget nyújt a szabad tiol csoportot elérhető helyen tartalmazó fehérjék szelektív megjelölésére, melyhez ígéretes megoldásnak tűnik a vinil-szulfonokkal történő Michael-addíció.11  3 2. Célkitűzések  A doktori kutatásaim során a fluoreszcens jelzés bevitelére alkalmas bioortogonális ligációs eljárások mindkét oldalának fejlesztésével foglalkoztam, új kémiai hírvivőket és fluoreszcens jelzővegyületeket állítottam elő, valamint vizsgáltam tulajdonságaikat és felhasznál-hatóságukat. Munkám ezzel összhangban három fő részre tagolódik:  Vinil-szulfon motívumra épülő cisztein-specifikus kémiai hírvivők és fluoreszcens jelzővegyületek (1-5) előállítása és a jelölési reakció szelektivitás- és sebesség vizsgálata.  Reaktív, de kellően stabil tetrazinok (6-9) szintézise és szubsztituensek hatásának vizsgálata a reaktivitásra az elektronikus effektus és sztérikus gátlás alapján.  A távoli vörös – közeli IR tartományban emittáló, ún. mega-Stokes tulajdonsággal rendelkező bioortogonális fluorofórok (10-12) tervezése és energia-transzfer rendszerben, illetve oligonukleotidok jelölésében való felhasználásuk.   3. Saját eredmények   A kutatásaim során elért eredményeket a következő pontokban foglalhatjuk össze.  3.1. Cisztein-specifikus jelzővegyületek  Elsőként divinil-szulfonból (14) kiindulva optimalizált reakciókörülmények mellett vinil-szulfon és alkin funkciós csoportokkal rendelkező bifunkciós kémiai hírvivőt állítottam elő (1), majd a vízoldékonyság növelése érdekében egy etoxi csoporttal hosszabbított változatot (2) terveztem. Az azid csoport beviteléhez elsőként egy amin funkciós csoportot tartalmazó köztiterméket állítottam elő (19), melyhez 6-azido-hexánsavat kapcsolva nyertem a 3 célterméket. A cisztein-specifikus fluoreszcens jelzővegyületeket az alkin funkcióval rendelkező hírvivőkből (1, 2) és 3-azido-7-dietilaminokumarinból (20) állítottam elő réz-katalizált azid-alkin cikloaddíciós reakcióban (1. ábra) 4  a) kat. tBuOK, abs. THF, N2, 25 °C, 45 min, 68% b) NaOH, 0 °C → 45 °C, 3 h, N2, 80% c) 14, kat. tBuOK, abs. THF, N2, 25 °C, 45 min, 58% d) Boc2O, DCM, 25 °C, 14 h, 67% e) 14, kat. tBuOK, abs. THF, N2, 25 °C, 45 min, 52% f) CH3COCl, abs. MeOH, 0 °C → 25 °C, 4 h, 98% g) 6-azidohexánsav, EDAC×HCl, TEA, DCM, 25 °C, 1,5 h, 35% h) 1 vagy 2, kat. CuI, TEA MeCN, 25 °C, 3 h, 37-64% 1. ábra. Vinil-szulfon motívumot tartalmazó jelzővegyületek előállítása.  Az előállított vegyületek szelektivitás- és pH-függő reaktivitás vizsgálatát DTHFPIC és KGDTHFPIC szekvenciájú modellpeptideken végeztük. A jó vízoldhatósággal rendelkező vinil-szulfon reagensek fiziológiás körülmények között specifikus affinitást mutattak a tiolcsoporttal szemben, ezzel a modellpeptidek gyors, szelektív és hatékony jelölését téve lehetővé a cisztein oldalláncán keresztül. A 2 bifunkciós kémiai hírvivővel és azid funkciós csoporttal rendelkező fluorogén jelzővegyületekkel (20-23) szekvenciális fluorogén jelölést valósítottuk meg (KGDTHFPIC + 2, majd második lépésben + 20-23). Az ilyen, kiindulási állapotban nem, de a kapcsolási reakció során fluoreszcensé váló jelzővegyületekkel rámutattunk a kétlépéses eljárás előnyére a közvetlen, egylépéses fluoreszcens jelöléssel (KGDTHFPIC + 5) szemben, miszerint nagymértékben csökkenthető az elreagálatlan jelzővegyület okozta háttérfluoreszcencia (2. ábra, 6 és 8 sáv vs. 5 és 9-12 sáv). 5  1 KGDTHFPIC 7 KGDTHFPIC-5 2 KGDTHFPIC-2 8 KGDTHFPIC + 5 3 KGDTHFPIC-5 9 KGDTHFPIC-2 + 20 + Cu(I) 4 KGDTHFPIC-2 + 20 10 KGDTHFPIC-2 + 21 + Cu(I) 5 KGDTHFPIC-2 + 20 + Cu(I) 11 KGDTHFPIC-2 + 22 + Cu(I) 6 KGDTHFPIC + 5 12 KGDTHFPIC-2 + 23 + Cu(I)  2. ábra. A gélek UV fénnyel való besugárzása során kapott képek.   3.2. Reaktív tetrazinszármazékok  A tetrazinok fordított elektronigényű Diels-Alder reakcióban való reaktivitása viszonylag jó valószínűséggel becsülhető a diének LUMO energiaszintjei alapján. Leegyszerűsítve elmondható, hogy a tetrazinok elektronhiányossága arányos azok reakciókészségével. Ezt és a további funkcionalizálhatóságot szem előtt tartva a reaktív tetrazinszármazékok előállításhoz a jó elektronszívó tulajdonsággal rendelkező 6-cianonikotinsavat (24) választottam. A sztérikus hatások vizsgálata céljából három különböző, nikotinsavamidra (25) épülő tetrazint állítottam elő: egy szimmetrikusan szubsztituált származékot (6), egy nem-szimmetrikus, egyik oldalt metilcsoportot tartalmazó változatot (7) és egy monoszubsztituált tetrazint (8). A reaktivitás/stabilitás arány befolyásolására az amid csoport kapcsolódási sorrendjének meg-változtatásával tettem kísérletet egy amidopiridinre (27) épülő tetrazin szintézisével (3. ábra).  6  a) HNEt2, HOBt, HBTU, EDIPA, THF, 25 °C, 16 h, 87% b) 1) N2H4×H2O, THF, Δ, 16 h; 2) [NOx], CH2Cl2, 25 °C, 15 min, 30% c) 1) N2H4×H2O, MeCN, Δ, 16 h; 2) [NOx], CH2Cl2, 25 °C, 15 min, 10% d) 1) formamidin-acetát, N2H4×H2O, EtOH, Δ, 16 h; 2) izopentil-nitrit, CH2Cl2, 25 °C, 3 h, 42% e) CH3COCl, TEA, abs. DCM, 0 °C → 25 °C, 18 h, 66% f) 1) formamidin-acetát, N2H4×H2O, S, 60 °C, 16 h; 2) izopentil-nitrit, CH2Cl2, 25 °C, 3 h, 13% 3. ábra. A 6, 7, 8 és 9 modell tetrazinok előállítása.  A tetrazinok vizsgálatához összehasonlítási alapként az irodalomban legtöbbször alkal-mazott dipiridil-tetrazint (DPT, 28) választottam. A tetrazinok várható reaktivitásának becslé-sére azok LUMO energiái alapján tettünk kísérletet12, majd meghatároztuk a jellemző sebességi állandóikat etil-vinil-éterrel (EVE, 29), ciklooktinnal (CyO, 30) és az oxTCO (31) transz-ciklooktén származékkal. Végül a gyakorlati felhasználhatóság mérlegeléséhez az egyes tetra-zinszármazékok fiziológiáshoz hasonló körülmények közötti stabilitását is vizsgáltam (4. ábra).  Tetrazin t1/2 LUMO k2 / M-1s-1 (h) (eV) EVEa CyOa oxTCOb COMBOb TCOb DPT 3 0,28 0,0012 --- 2100 --- --- 6 4 0,46 0,008 0,23 7900 --- --- 7 88 0,83 0,00145 --- 1000 210 4000 8 4 0,71 0,024 6,25 17000 --- --- 9 6 0,69 0,010 2,89 --- --- --- a DMSO/víz = 9/1 v/v), 25 °C; b 1% DMSO pH = 7,2 PBS pufferben, 36 °C. 1. táblázat. A tetrazinok LUMO energiái, stabilitása és dienofilekkel szembeni reaktivitása. 7        4. ábra. A dienofilek (bal) és a szerkezetek átmeneti állapotokban (8+Cyo, 6+Cyo, jobb).  A monoszubsztituált 8 tetrazin az elektronszívó csoportok és LUMO energia alapján reaktívabbnak várt 6-hoz képest aktívabbnak mutatkozott (1. táblázat), ezzel rámutatva a sztérikus hatások fontos szerepére. A tapasztalati eredményeket olyan kvantumkémiai számításokkal is alátámasztottuk, melyben a dienofil partnert is figyelembe vevő átmeneti állapok alapján számított aktiválási gátakból következtettünk a reakciósebességek viszonyára. Ezzel a reaktivitásra olyan új, az átmeneti állapotot és így a reakciópartnert is figyelembe vevő predikciós modell állítható fel, mely a korábban alkalmazott, csupán a LUMO energiákat figyelembe vevő módszernél pontosabban jósolja meg tetrazinok reaktivitását. A kedvező reaktivitás/stabilitás viszonnyal rendelkező 7 származék gyakorlati felhasználhatóságának vizsgálatakor meghatároztam reaktivitását a COMBO (42) ciklooktinnal és az általánosan használt TCO (43) transz-ciklookténnel szemben is. A kedvező eredmények után a szabad karboxilcsoporttal rendelkező származékból bioortogonalizált nukleotid építő-elemet előállítottam elő, melyet szilárd fázisú technológiával oligonukleotid láncba építettünk be (DNS-1) és sikerrel jelöltünk meg fluoreszcens jelzővegyület (34) alkalmazásával (5. ábra). 5. ábra. A tetrazint tartalmazó DNS-1 lánc jelölése COMBO-fluoreszceinnel (51). 8 3.3. Lepidinium-alapú fluoreszcens jelzővegyületek  A lepidínium vázelem felhasználásával azid és alkin funkciós csoportokkal ellátott, mega-Stokes tulajdonságot mutató és a távoli vörös – közeli IR tartományban emittáló fluoreszcens jelzővegyületeket állítottam elő (10, 11, 12) (6. ábra).  a) 6-jódhexin, MeCN, Δ, 21 h, 86% b) 1) 1,3-dijódpropán, MeCN, Δ, 20 h, 90%; 2) NaN3, MeCN, Δ, 18 h, 84% c) 1) 4-dimetilaminobenzaldehid vagy 7-(dietilamino)-3-formilkumarin vagy a 6-(dietilamino)-benzofurán-2-karbaldehid, piperidin, EtOH, Δ, 3 h; 2) NH4PF6, EtOH/H2O, 95% (10a), 85% (10b), 90% (11a), 73% (11b), 93% (12a), 87% (12b) 6. ábra. A 10, 11 és 12 lepidínium-vázas fluorofórok előállítása. A kereskedelmi forgalmazás során felmerülő igények kielégítéshez a reakciókörülmények optimalizálásával gyors, jó termelést és tisztaságot biztosító szintetikus eljárást dolgoztam ki. A fotofizikai adataik alapján a fluorofórok optimálisak olcsó, kereskedelmi forgalomban elérhető lézerrel való gerjesztésre, és nagy (~150 nm) Stokes-eltolódásuknak köszönhetően a gerjesztési és emissziós spektrumok szétválásával ideálisan használhatóak fel energiatranszfer rendszerekben. Ezt kihasználandó, a 10 jelzővegyületet és daunomicint (Dau), egy fluoreszcens rákellenes vegyületet tartalmazó modellrendszert terveztünk, melyben a két fluorofór energiatranszfer (FRET) kapcsolatban áll egymással. A választott lepidínium fluorofór nagy hatékonysággal törte le a daunomicin fluoreszcenciáját, ezzel 90%-kal csökkentve annak emisszióját. Az összekötő egység hidrolízisével és így a két vegyület szétválasztásával a daunomicin fluoreszcenciája teljes mértékben visszaállíthatónak bizonyult (7. ábra).  9 0 20 40 60 80 100 120 140 1600,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0500 550 600 650 700 750 80001020304050607080900 5 10 15 20 25 3012345678910500 550 600 650 700 750 800020406080100120I / I 0Idő / min155 min0 minFluoreszcens intenzitás / a.u.Hullámhossz / nmI / I 0Idő / hFluoreszcens intenzitás / a.u.Hullámhossz / nm0 h30 h0 20 40 60 80 100 120 140 1600,10,20,30,40,50,60,70,80,91,500 550 600 650 700 750 80001020304050607080901500 550 600 650 700 750 800020406080100120I / I 0Idő / min155 min0 minFluoreszcens intenzitás / a.u.Hullámhossz / nmI / I 0Idő / hFluoreszcens intenzitás / a.u.Hullá h  / nm  7. ábra. A fluoreszcens intenzitás változása 592 nm-en a daunomicin és 10 között a FRET-rendszer kialakulásakor (bal) és az összekötő egység hidrolízisekor (jobb).  Az előállított jelzővegyületek egy másik tagjával (11) alkin funkciós csoporttal különbözően szubsztituált oligonukleotidok (DNS-2,3) fluoreszcens jelölését valósítottuk meg. A jelölés hatására mindkét esetben a fluoreszcencia intenzitás nagymértékű növekedését értük el, azonban a komplementer szállal való anelláció hatására jelentős különbség mutatkozott (8. ábra). A jelenséget a fotofizikai kísérletek alapján a lokális polaritás megváltozásával magyarázhattuk, mely egyben rámutatott a fluoreszcens jelzés (5-uracil vs. 2’-ribóz) kapcsolódási pontjának fontosságára és a hibridizáció után kialakuló kettős szálban elhelyezkedő különböző pozíciójára.  8. ábra. A jelzővegyület és az oligonukleotidok abszorpciós és fluoreszcens spektrumai. 10 A doktori értekezés alapjául szolgáló publikációk:  1. G. B. Cserép, Zs. Baranyai, D. Komáromy, K. Horváti, Sz. Bősze, P. Kele, „Fluorogenic tagging of peptides via Cys residues using thiol-specific vinyl sulfone affinity tags” Tetrahedron 2014, 70, 5961. 2. G. B. Cserép, O. Demeter, E. Bätzner, M. Kállay, H-A. Wagenknecht, P. Kele, „Synthesis and Evaluation of Nicotinic Acid Derived Tetrazines for Bioorthogonal Labeling” Synthesis 2015, közlésre elfogadva. 3. G. B. Cserép, K. N. Enyedi, A. Demeter, G. Mező, P. Kele: „NIR Mega-Stokes Fluorophores for Bioorthogonal Labeling and Energy Transfer Systems – An Efficient Quencher for Daunomycin” Chem. Asian J. 2013, 8, 494. 4. C. Stubinitzky, G. B. Cserép, E. Bätzner, P. Kele, P. H-A. Wagenknecht, „2’-Deoxyuridine Conjugated with a Reactive Monobenzocyclooctyne as a DNA Building Block for Copper-Free Click-type Postsynthetic Modification of DNA” Chem. Commun. 2014, 50, 11218.       ___________________________________________________________________________  1 B. Valeur Molecular Fluorescence Principles and Applications; Wiley-VCH Verlag GmbH: Weinheim, 2002. 2 J. R. Lakowicz Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed.; Springer Publishing, 2006. 3 P. M. Goodwin, W. P. Ambrose, R. A. Keller Accounts of Chemical Research 1996, 29, 607. 4 B. Huang, M. Bates, X. Zhuang Annu Rev Biochem 2009, 78, 993. 5 http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014/. 6 C. P. Ramil, Q. Lin Chem Commun (Camb) 2013, 49, 11007. 7 E. Saxon, C. R. Bertozzi Science 2000, 287, 2007. 8 D. M. Patterson, L. A. Nazarova, J. A. Prescher ACS Chem Biol 2014, 9, 592. 9 K. E. Beatty Mol Biosyst 2011, 7, 2360. 10 M. Grammel, H. C. Hang Nat Chem Biol 2013, 9, 475. 11 J. Morales-Sanfrutos, F. J. Lopez-Jaramillo, F. Hernandez-Mateo, F. Santoyo-Gonzalez J Org Chem 2010, 75, 4039. 12 Gaussian 09 csomaggal, Hartree–Fock közelítés, 6-311++G** bázison és B3LYP funkcionállal optimalizált geometriákon.  

Bioortogonális jelzésre alkalmas kémiai hírvivők és fluoreszcens jelzővegyületek szintézise és alkalmazása

https://edit.elte.hu/xmlui/bitstream/handle/10831/29917/CserepGergely_T%c3%a9zisek-hu.pdf?sequence=3&isAllowed=y

Bioortogonális jelzésre alkalmas kémiai hírvivők és fluoreszcens jelzővegyületek szintézise és alkalmazása

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

ELTE Digital Institutional Repository (EDIT)