BERTHOUX, Lionel

DUFOUR, Caroline

MÉRINDOL, Natacha

Dépôt numérique de UQTR

Caroline DUFOUR, Natacha MÉRINDOL et Lionel BERTHOUXLaboratoire d’immunité antivirale – Université du Québec à Trois-Rivières	Introduction Conclusion Bibliographie Généralité:  L’un	des	obstacles	majeurs	au	développement	d’un	traitement	cura6f	du	SIDA	réside	dans	 la	capacité	du	VIH-1	à	 infecter	 les	cellules	de	manière	latente.	Des	études	portant	sur	l’approche	«	shock	and	kill	»1	ont	mis	en	évidence	l’eﬀet	ac6vateur	de	la	voie	de	signalisa6on	NF-κB	sur	les	virus	VIH-1	latents,	puisque	le	promoteur	du	VIH-1	possède	des	sites	pour	NF-κB	 et	 AP-1.	 TRIM5α	 est	 une	 protéine	 cellulaire	 s6mulée	 par	 les	interférons	de	type	I	(IFN-I)	qui	peut	bloquer	la	réplica6on	des	rétrovirus	à	un	stade	précoce	de	l’infec6on2.	Plusieurs	équipes,	dont	 la	nôtre,	ont	démontré	que	TRIM5α,	en	plus	de	causer	 la	décapsida6on	prématurée	du	virus,	serait	un	détecteur	pour	 l’ac6va6on	des	voies	de	signalisa6on	de	 la	 défense	 an6virale	 de	 l’immunité	 innée,	 principalement	 les	 voies	NF-κB,	 AP-1	 et	 possiblement	 IRF3.	Nous	 avons	 antérieurement	 produit	un	 mutant	 de	 TRIM5α	 humain	 (huTRIM5α	 R332G-R335G)	 capable	 de	reconnaitre	 la	 capside	 et	 de	 restreindre	 l’infec6on	 du	 VIH-13,	 mais	l’importance	 de	 son	 rôle	 d’ac6vateur	 de	 l’immunité	 innée	 dans	 la	protec6on	contre	le	VIH-1	n’a	pas	encore	été	démontré.  Objectifs:  Déterminer	 et	 caractériser	 le	 rôle	 ac6vateur	 de	 l’immunité	 innée	an6virale	 de	 huTRIM5α	 R332G-R335G	 dans	 la	 restric6on	 de	 l’infec6on	au	VIH-1,	ainsi	que	l’eﬀet	de	cet	état	an6viral	sur	la	réac6va6on	des	virus	latents.	Procédure expérimentale Production de vecteurs rétroviraux à partir de la nouvelle construction Restriction de HIV-1-NL4.3-DsRed par huTRIM5α R332G-R335G Méthodologie:  •  Produire	 des	 lignées	 cellulaires	 monocytaires	 (THP-1),		lymphocytaires	 (Sup-T1)	et	 lymphocytaires	avec	un	provirus	VIH-1-GFP	 latent	 (J-Lat	 6.3)	 surexprimant	 stablement	 huTRIM5α	 R332G-R335G	ou	la	version	sauvage	non	restric6ve;	•  Conﬁrmer	 l’eﬃcacité	 et	 la	 spéciﬁcité	 de	 restric6on	 du	 VIH-1	 par	huTRIM5α	R332G-R335G	dans	les	cellules	transformées;	•  Évaluer	 l’eﬀet	 de	 réac6va6on	 des	 virus	 VIH-1	 latents	 lors	 de	 la	restric6on	du	VIH-1	par	huTRIM5α	R332G-R335G;	•  Construc6on	d’un	vecteur	rétroviral	VIH-1-NL4.3	exprimant	le	gène	rapporteur	DsRed	à	la	place	de	GFP.	Réactivation des virus latents lorsqu’il y a restriction par TRIM5α Construction de pNL4.3-DsRed, pour effectuer des doubles infections  Remerciement FRQS	–	Réseau	SIDA	et	Maladies	infec7euses	0.01 0.1 1 10 1000.010.1110100µl de VIH-NL4.3-GFP ajouté% de cellules exprimant GFPTHP-10.01 0.1 1 10 1000.010.1110100µl de VIS-mac239-GFP ajouté% de cellules exprimant GFP0.01 0.1 1 10 1000.1110100µl de VIH-NL4.3-GFP ajouté% de cellules exprimant GFPSup-T10.01 0.1 1 10 1000.1110100µl de VIS-mac239-GFP ajouté% de cellules exprimant GFP pMIHpMIH huTRIM5α WTpMIH huTRIM5α GGpMIHhuTRIM5αhuTRIM5α GG012345% de cellules exprimant GFPJ-Lat 6.3 24 h post-infectionpMIHhuTRIM5αhuTRIM5α GG020406080% de cellules exprimant DsRedJ-Lat 6.3 24 h post-infectionpMIHhuTRIM5αhuTRIM5α GG012345% de cellules exprimant GFPJ-Lat 6.3 48 h post-infectionpMIHhuTRIM5αhuTRIM5α GG020406080% de cellules exprimant DsRedJ-Lat 6.3 48 h post-infectionpMIHhuTRIM5αhuTRIM5α GG012345% de cellules exprimant GFPJ-Lat 6.3 72 h post-infection10 µl30 µl100 µlRPMIpMIHhuTRIM5αhuTRIM5α GG020406080% de cellules exprimant DsRedJ-Lat 6.3 72 h post-infection10 µl30 µl100 µlRPMIRestriction spécifique du VIH-1 par huTRIM5α R332G-R335G 0.01 0.1 1 10 1000.0010.010.1110100µl de VIH-1-NL4.3-GFP ajouté% de cellules exprimant GFPTHP-10.01 0.1 1 10 1000.0010.010.1110100µl de VIH-1-NL4.3-DsRed ajouté% de cellules exprimant DsRedpMIHpMIH huTRIM5α WTpMIH huTRIM5α GGTHP-1Structure de TRIM5α R332G-R335G  Nos	 résultats	 préliminaires	 nous	 permeeent	 d’observer	 que	 la	 restric6on	 du	 VIH-1	 par	huTRIM5αR332G-R335G	 engendrait	 la	 réac6va6on	 des	 virus	 latents.	 Toutefois,	 le	 vecteur	 VIH-1	pCSRW,	 u6lisé	 pour	 sa	 ﬂuorescence	 rouge,	 ne	 con6ent	 pas	 autant	 de	 gènes	 du	 VIH-1	 que	pNL4.3ΔenvΔnef-GFP,	ce	qui	peut	expliquer	le	faible	taux	de	réac6va6on	observé	dans	les	cellules	J-Lat	6.3	 huTRIM5α	 R332G-R335G.	 Une	 construc6on	 pNL4.3ΔenvΔnef-DsRed	 a	 pu	 être	 créée,	 et	 nos	résultats	 démontrent	 que	 ce	 nouveau	 virus	 est	 tout	 autant	 infec6eux	 que	 HIV-1-NL4.3-GFP.	 Nous	avons	également	mis	en	évidence	que	huTRIM5α	R332G-R335G	restreint	les	deux	construc6ons	virales	de	façon	similaire.		Perspec7ves:	•  Évaluer	 les	propriétés	d’ac6va6on	de	 l’immunité	 innée	an6virale	de	huTRIM5α	R332G-R335G	par	Western	Blot,	microscopie	à	immunoﬂuorescence	et	q-PCR;	•  Évaluer	l’eﬀet	protecteur	de	l’état	an6viral,	créé	par	la	restric6on	du	VIH-1	par	huTRIM5α	R332G-R335G,	lors	d’une	seconde	infec6on;	•  Iden6ﬁer	 les	 voies	 d’ac6va6on	 de	 l’immunité	 innée	 impliquées	 et	 conﬁrmer	 leur	 importance	 à	l’aide	de	knockdowns	et	d’inhibiteurs	pharmacologiques.	Rôle de TRIM5α dans la  restriction du VIH-1 et l’activation de l’immunité innée 1.Deeks,	S.	G.	HIV:	Shock	and	kill.	Nature	487,	439-440,	doi:10.1038/487439a	(2012).	2.	Merindol,	N.	&	Berthoux,	L.	Restric6on	Factors	in	HIV-1	Disease	Progression.	Curr	HIV	Res	13,	448-461	(2015).	3.	Pham,	Q.	T.,	Bouchard,	A.,	GrüPer,	M.	G.	&	Berthoux,	L.	Genera6on	of	human	TRIM5alpha	mutants	with	high	HIV-1	restric6on	ac6vity.	Gene	Therapy	17,	859-871,	doi:10.1038/gt.2010.40	(2010).			ARN du VIH et promoteur 

Importance de l'activation de l'immunité innée dans le mécanisme d'action anti-VIH-1 d'approches de thérapies géniques utilisant TRIM5a.

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