Досліджена кінетика ферментної етерифікації та розроблена її математична модель. Як біокаталізатор використано 1,3-специфічний фермент Ліпозим RM IM ("Novozymes", Данія). Виконано аналіз зразків вихідної суміші та продуктів етерифікації. На основі сучасних методів обробки експериментальних даних були визначені константа швидкості та початкова швидкість реакції.The enzymatic esterification kinetics was investigated and its mathematical model was elaborated. 1,3-specific enzyme Lipozyme RM IM ("Novozymes", Denmark) was used as a biocatalyst. The analysis of samples of feedstock and interesterified products was fulfilled. On basis of contemporary methods of experimental data processing the rate constant and initial reaction rate were determined

Катасонова, Н. Г.

Некрасов, Павло Олександрович

Решетняк, Н. В.

Library of National Technical University "Kharkiv Polytechnic Institute"

130
УДК 665.383:577.152.31
П.О. НЕКРАСОВ, канд. техн. наук; Н.В. РЕШЕТНЯК, НТУ «ХПІ»
Н.Г. КАТАСОНОВА, студентка НТУ «ХПІ»
ДОСЛІДЖЕННЯ КІНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНОЇ
ЕТЕРИФІКАЦІЇ
Досліджена кінетика ферментної етерифікації та розроблена її математична модель. Як біокаталі-
затор використано 1,3-специфічний фермент Ліпозим RM IM ("Novozymes", Данія). Виконано
аналіз зразків вихідної суміші та продуктів етерифікації. На основі сучасних методів обробки екс-
периментальних даних були визначені константа швидкості та початкова швидкість реакції.
The enzymatic esterification kinetics was investigated and its mathematical model was elaborated.
1,3-specific enzyme Lipozyme RM IM ("Novozymes", Denmark) was used as a biocatalyst. The analysis
of samples of feedstock and interesterified products was fulfilled. On basis of contemporary methods of
experimental data processing the rate constant and initial reaction rate were determined.
В традиційній технології етерифікація протікає при нагріванні безводно-
го гліцерину з надлишком необхідної кількості відповідних жирних кислот
при температурі 150 – 200 °С. Для прискорення реакції застосовують сильні
мінеральні кислоти, бензол- або толуолсульфокислоти. Застосування біока-
талізаторів – ферментів – дозволяє відмовитись від використання небезпеч-
них реагентів та значно пом’якшити умови проведення реакції.
Ферменти призначені для роботи в живих клітинах, тому їх можна вико-
ристовувати при атмосферному тиску, відносно низьких температурах, сере-
дніх значеннях кислотності. Ферментні технології не потребують жаростій-
кого, а також стійкого до корозії і високого тиску обладнання, що зменшує
обсяг необхідних інвестицій. До того ж ферментам притаманна висока ефек-
тивність і здатність до біологічного розкладення.
Ліпази (триацилгліцеролгідролази К.Ф.3.1.1.3) є універсальними ферме-
нтами, що використовуються для перетворення ліпідів. Субстратами ліпаз є
складні ефіри, зокрема ацилгліцерини, та їх похідні. Ліпази більш інших
представників класу гідролаз мають здатність каталізувати різні типи реак-
цій.
Головна перевага реакцій, що каталізуються ліпазами, перед реакціями,
що використовують хімічні каталізатори, полягає у можливості отримання з
мінімумом або відсутністю побічних речовин великої різноманітності цільо-
131
вих продуктів, що мають різний склад і властивості, в залежності від суб-
стратної специфічності, стерео або позиційній специфічності конкретного
ферменту [1].
Сфера використання ферментативної етерифікації досить різноманітна.
При етерифікації та перетерифікації жирних кислот зі стеролами та ста-
нолами за допомогою ліпаз з Rhizomucor miehei, Candida antarctica і Carica
papaya отримують ефіри, що можуть бути використані при виробництві рід-
кокристалічних екранів [2].
Етерифікація сумішей мононенасичених жирних кислот з довгими і ду-
же довгими ланцюгами з відповідними спиртами і використанням як каталі-
затор препарату 1,3-специфічної ліпази Ліпозим дає воскові складні ефіри з
майже теоретичним виходом [3]. Склад цих ефірів схожий з натуральним во-
ском, наприклад з воском жожоба, що має велику промислову цінність.
У той же час за допомогою препарату Novozym 435 здійснено фермента-
тивний синтез ефірів ферулової кислоти [4]. Найвищого ступеню перетво-
рення вдалось досягти при співвідношенні спирт : кислота, ріному 1 : 1 та
температурі 60 °С.
Запатентовано [5] ферментний спосіб одержання органічних ефірів ас-
корбінової чи ерітроборової кислот взаємодією цих кислот з органічними
кислотами чи їхніми ефірами типу R1COOR2 (R1-алкіл, R2 – H, метил, етил чи
пропил)  в органічному розчиннику в присутності ліпази, іммобілізованої на
нерозчинному носії. Отримані в такий спосіб ефіри добре розчинні в харчо-
вих жирах і можуть бути використані для запобігання окислювання жирових
продуктів, наприклад, майонезу, маргарину, горіхів тощо.
В роботі інших дослідників [6] показано можливість отримання гліцери-
дів зі середньоланцюговими ацилами (капрінова кислота) методом прямої
етерифікації гліцерину відповідною жирною кислотою у присутності ліпази з
Candida rugosa. Оптимальними умовами реакції, при яких вихід гліцеридів є
максимальним, є температура 37 °С; час реакції – 24 години; молярне спів-
відношення субстратів — капрінової кислоти та гліцерина – 2,5, кількість лі-
пази 100 мг. При цьому використовувались розчинники – гексан, ізооктан та
н-октан, що сприяло зниженню в’язкості системи та солюбілізації капрінової
кислоти. Ще одним напрямком застосування етерифікації за участю фермен-
тів є синтез неповних ацилгліцеринів, зокрема діацилгліцеринів (ДАГ).
Останні дослідження показали, що дієти, які включають в себе продукти,
збагачені ДАГ, у людей з надлишковою вагою сприяють її зниженню в сере-
132
дньому на 3,6 %, а маси жира – на 8,3 % [7]. Ці продукти функціонального
призначення вже представлено на ринках США та Японії.
Одним із шляхів кращого розуміння нюансів біокаталітичної етерифіка-
ції жирів є вивчення протікання реакції у часі.
В роботі було досліджено кінетику ферментативної етерифікації гліце-
рину жирними кислотами (число нейтралізації 196,4 мг КОН/г), які були ви-
ділені з традиційної для вітчизняної промисловості сировини – соняшникової
олії («Олейна»). До складу цієї олії переважно входять корисні для організму
людини біологічно активні ненасичені жирні кислоти – олеїнова та лінолева.
Реакція каталізувалась за допомогою ферментного препарату Ліпо-
зим RM IM виробництва датської фірми «Novozymes».
Ліпозим RM IM являє собою іммобілізований препарат продовольчого
класу мікробної 1,3-специфічної ліпази  (ЄС 3.1.1.3) з Rhizomucor miehei,
отриманної за допомогою глибинного бродіння генетично модифікованого
мікроорганізму Aspergillus oryzae [8]. Як носій, що використано для іммобілі-
зації, застосовано макропористу аніонообмінну смолу.
Умови етерифікації: реакцію здійснювали в тонкому шарі при постійно-
му перемішуванні під вакуумом (залишковий тиск 3 мм. рт. ст.) при темпера-
турі 60 °С. Співвідношення гліцерин : жирні кислоти дорівнювало
1 моль : 2 моль, кількість ферментного препарату – 10 % мас. по відношенню
до маси реакційної суміші. Тривалість реакції – 1 година. Кінетика реакції
досліджувалась за зміною вмісту жирних кислот.
Через визначені проміжки часу відбирали проби, в яких визначали зна-
чення кислотного числа, попередньо швидко відокремивши центрифугуван-
ням залишки ферментного препарату. Далі за знайденими значеннями числа
нейтралізації, кислотного числа та густини обчислювали концентрацію жир-
них кислот в зразках, що аналізувались.
Отримані дані (середнє значення двох досліджень) наведені на рисунку.
Математична модель. Залежність на рис. має вигляд експоненти. Зага-
льне рівняння моделі:
,)( 0
tkeCtC 
де C(t) – концентрація тристеарину в реакційній суміші через визначе-
ний час t, моль/л; C0 – початкова концентрація тристеарину, моль/л; k – конс-
танта швидкості, хв-1; t – час реакції, хв.
133
Визначення константи швидкості  здійснювалось методом нелінійної ре-
гресії за допомогою програмного пакету MATLAB (виробник – фірма
The MathWorks, Inc.). Обчислене значення було наступним: k = 0,0232 хв–1.
Початкова швидкість реакції визначалась шляхом диференціювання рівняння
за часом та знаходження швидкості в нульовий момент часу реакції:
v0 = 0,0668 моль/хв.
Список літератури: 1. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. – М.: ДеЛи
принт, 2002. – 336 с. 2. Weber Nikolaus, Weitkamp Petra, Mukherjee Kumar D. Steryl and stanyl esters
of fatty acids by solvent-free esterification and transesterification in vacuo using lipases from Rhizomucor
miehei, Candida antarctica, and Carica papaya // J. Agr. and Food Chem.– 2001.– Vol. 49, № 11.
– P.5210–5126. 3. Mukherjee K. Lipase-catalyzed reactions for modification of fats and other lipids //
Biocatalysis, 1990, Vol.3.– P.277–293. 4. Compton David L., Laszlo Joseph A., Berhow Mark A. Lipase-
catalyzed synthesis of ferulate esters // JAOCS.– 2000.– Vol. 77, №5.– P.513–519. 5. Пат. 5071753
США, МКИ5 С 12 Ρ 17/04, С 12 Ρ 7/40. Process for enzymatic preparation of organic esters of ascorbic
acid or erythorbic acid: Пат. 5071753 США, МКИ5 С 12 Ρ 17/04, С 12 Ρ 7/40 Enomoto Kaheniko,
Miymori Takao та ін. – № 607676;  Заявл. 01.11.90; Опубл. 10.12.91.– 3 с. 6. Wong W.C, Basri
M.,Razak С.N.A., Salleh A.B. Synthesis of medium-chain glycerides  using lipase from Candida rugosa //
JAOCS.– 2000.– Vol. 77, №1.– P.85–88. 7. Maki KC, Davidson MH, Tsushima R, Matsuo N etc. Con-
sumption of diacylglycerol oil as part of a reduced-energy diet enhances loss of body weight and fat in
comparison with consumption of a triacylglycerol control oil // Am. J. Clin. Nutr.– 2002.– Vol. 76.–
P.1230–1236.
8. Матеріали фірми "Novozymes".
Надійшла до редколегії 10.04.07
Рисунок – Зміна концентрації жирних кислот в реакційній суміші.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 10 20 30 40 50 60
Час, хвилини
Ко
нц
ен
тр
ац
ія
 ж
ир
ни
х
ки
сл
от
, м
ол
ь/
л


Дослідження кінетики ферментативної етерифікації

Досліджена кінетика ферментної етерифікації та розроблена її математична модель. Як біокаталізатор використано 1,3-специфічний фермент Ліпозим RM IM (&quot;Novozymes&quot;, Данія). Виконано аналіз зразків вихідної суміші та продуктів етерифікації. На основі сучасних методів обробки експериментальних даних були визначені константа швидкості та початкова швидкість реакції.The enzymatic esterification kinetics was investigated and its mathematical model was elaborated. 1,3-specific enzyme Lipozyme RM IM (&quot;Novozymes&quot;, Denmark) was used as a biocatalyst. The analysis of samples of feedstock and interesterified products was fulfilled. On basis of contemporary methods of experimental data processing the rate constant and initial reaction rate were determined

eNTUKhPIIR Electronic National Technical University "Kharkiv Polytechnic Institute"; Institutional Repository

130УДК 665.383:577.152.31П.О. НЕКРАСОВ, канд. техн. наук; Н.В. РЕШЕТНЯК, НТУ «ХПІ»Н.Г. КАТАСОНОВА, студентка НТУ «ХПІ»ДОСЛІДЖЕННЯ КІНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНОЇЕТЕРИФІКАЦІЇДосліджена кінетика ферментної етерифікації та розроблена її математична модель. Як біокаталі-затор використано 1,3-специфічний фермент Ліпозим RM IM ("Novozymes", Данія). Виконаноаналіз зразків вихідної суміші та продуктів етерифікації. На основі сучасних методів обробки екс-периментальних даних були визначені константа швидкості та початкова швидкість реакції.The enzymatic esterification kinetics was investigated and its mathematical model was elaborated.1,3-specific enzyme Lipozyme RM IM ("Novozymes", Denmark) was used as a biocatalyst. The analysisof samples of feedstock and interesterified products was fulfilled. On basis of contemporary methods ofexperimental data processing the rate constant and initial reaction rate were determined.В традиційній технології етерифікація протікає при нагріванні безводно-го гліцерину з надлишком необхідної кількості відповідних жирних кислотпри температурі 150 – 200 °С. Для прискорення реакції застосовують сильнімінеральні кислоти, бензол- або толуолсульфокислоти. Застосування біока-талізаторів – ферментів – дозволяє відмовитись від використання небезпеч-них реагентів та значно пом’якшити умови проведення реакції.Ферменти призначені для роботи в живих клітинах, тому їх можна вико-ристовувати при атмосферному тиску, відносно низьких температурах, сере-дніх значеннях кислотності. Ферментні технології не потребують жаростій-кого, а також стійкого до корозії і високого тиску обладнання, що зменшуєобсяг необхідних інвестицій. До того ж ферментам притаманна висока ефек-тивність і здатність до біологічного розкладення.Ліпази (триацилгліцеролгідролази К.Ф.3.1.1.3) є універсальними ферме-нтами, що використовуються для перетворення ліпідів. Субстратами ліпаз єскладні ефіри, зокрема ацилгліцерини, та їх похідні. Ліпази більш іншихпредставників класу гідролаз мають здатність каталізувати різні типи реак-цій.Головна перевага реакцій, що каталізуються ліпазами, перед реакціями,що використовують хімічні каталізатори, полягає у можливості отримання змінімумом або відсутністю побічних речовин великої різноманітності цільо-131вих продуктів, що мають різний склад і властивості, в залежності від суб-стратної специфічності, стерео або позиційній специфічності конкретногоферменту [1].Сфера використання ферментативної етерифікації досить різноманітна.При етерифікації та перетерифікації жирних кислот зі стеролами та ста-нолами за допомогою ліпаз з Rhizomucor miehei, Candida antarctica і Caricapapaya отримують ефіри, що можуть бути використані при виробництві рід-кокристалічних екранів [2].Етерифікація сумішей мононенасичених жирних кислот з довгими і ду-же довгими ланцюгами з відповідними спиртами і використанням як каталі-затор препарату 1,3-специфічної ліпази Ліпозим дає воскові складні ефіри змайже теоретичним виходом [3]. Склад цих ефірів схожий з натуральним во-ском, наприклад з воском жожоба, що має велику промислову цінність.У той же час за допомогою препарату Novozym 435 здійснено фермента-тивний синтез ефірів ферулової кислоти [4]. Найвищого ступеню перетво-рення вдалось досягти при співвідношенні спирт : кислота, ріному 1 : 1 татемпературі 60 °С.Запатентовано [5] ферментний спосіб одержання органічних ефірів ас-корбінової чи ерітроборової кислот взаємодією цих кислот з органічнимикислотами чи їхніми ефірами типу R1COOR2 (R1-алкіл, R2 – H, метил, етил чипропил)  в органічному розчиннику в присутності ліпази, іммобілізованої нанерозчинному носії. Отримані в такий спосіб ефіри добре розчинні в харчо-вих жирах і можуть бути використані для запобігання окислювання жировихпродуктів, наприклад, майонезу, маргарину, горіхів тощо.В роботі інших дослідників [6] показано можливість отримання гліцери-дів зі середньоланцюговими ацилами (капрінова кислота) методом прямоїетерифікації гліцерину відповідною жирною кислотою у присутності ліпази зCandida rugosa. Оптимальними умовами реакції, при яких вихід гліцеридів ємаксимальним, є температура 37 °С; час реакції – 24 години; молярне спів-відношення субстратів — капрінової кислоти та гліцерина – 2,5, кількість лі-пази 100 мг. При цьому використовувались розчинники – гексан, ізооктан тан-октан, що сприяло зниженню в’язкості системи та солюбілізації капріновоїкислоти. Ще одним напрямком застосування етерифікації за участю фермен-тів є синтез неповних ацилгліцеринів, зокрема діацилгліцеринів (ДАГ).Останні дослідження показали, що дієти, які включають в себе продукти,збагачені ДАГ, у людей з надлишковою вагою сприяють її зниженню в сере-132дньому на 3,6 %, а маси жира – на 8,3 % [7]. Ці продукти функціональногопризначення вже представлено на ринках США та Японії.Одним із шляхів кращого розуміння нюансів біокаталітичної етерифіка-ції жирів є вивчення протікання реакції у часі.В роботі було досліджено кінетику ферментативної етерифікації гліце-рину жирними кислотами (число нейтралізації 196,4 мг КОН/г), які були ви-ділені з традиційної для вітчизняної промисловості сировини – соняшниковоїолії («Олейна»). До складу цієї олії переважно входять корисні для організмулюдини біологічно активні ненасичені жирні кислоти – олеїнова та лінолева.Реакція каталізувалась за допомогою ферментного препарату Ліпо-зим RM IM виробництва датської фірми «Novozymes».Ліпозим RM IM являє собою іммобілізований препарат продовольчогокласу мікробної 1,3-специфічної ліпази  (ЄС 3.1.1.3) з Rhizomucor miehei,отриманної за допомогою глибинного бродіння генетично модифікованогомікроорганізму Aspergillus oryzae [8]. Як носій, що використано для іммобілі-зації, застосовано макропористу аніонообмінну смолу.Умови етерифікації: реакцію здійснювали в тонкому шарі при постійно-му перемішуванні під вакуумом (залишковий тиск 3 мм. рт. ст.) при темпера-турі 60 °С. Співвідношення гліцерин : жирні кислоти дорівнювало1 моль : 2 моль, кількість ферментного препарату – 10 % мас. по відношеннюдо маси реакційної суміші. Тривалість реакції – 1 година. Кінетика реакціїдосліджувалась за зміною вмісту жирних кислот.Через визначені проміжки часу відбирали проби, в яких визначали зна-чення кислотного числа, попередньо швидко відокремивши центрифугуван-ням залишки ферментного препарату. Далі за знайденими значеннями числанейтралізації, кислотного числа та густини обчислювали концентрацію жир-них кислот в зразках, що аналізувались.Отримані дані (середнє значення двох досліджень) наведені на рисунку.Математична модель. Залежність на рис. має вигляд експоненти. Зага-льне рівняння моделі:,)( 0tkeCtC де C(t) – концентрація тристеарину в реакційній суміші через визначе-ний час t, моль/л; C0 – початкова концентрація тристеарину, моль/л; k – конс-танта швидкості, хв-1; t – час реакції, хв.133Визначення константи швидкості  здійснювалось методом нелінійної ре-гресії за допомогою програмного пакету MATLAB (виробник – фірмаThe MathWorks, Inc.). Обчислене значення було наступним: k = 0,0232 хв–1.Початкова швидкість реакції визначалась шляхом диференціювання рівнянняза часом та знаходження швидкості в нульовий момент часу реакції:v0 = 0,0668 моль/хв.Список літератури: 1. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. – М.: ДеЛипринт, 2002. – 336 с. 2. Weber Nikolaus, Weitkamp Petra, Mukherjee Kumar D. Steryl and stanyl estersof fatty acids by solvent-free esterification and transesterification in vacuo using lipases from Rhizomucormiehei, Candida antarctica, and Carica papaya // J. Agr. and Food Chem.– 2001.– Vol. 49, № 11.– P.5210–5126. 3. Mukherjee K. Lipase-catalyzed reactions for modification of fats and other lipids //Biocatalysis, 1990, Vol.3.– P.277–293. 4. Compton David L., Laszlo Joseph A., Berhow Mark A. Lipase-catalyzed synthesis of ferulate esters // JAOCS.– 2000.– Vol. 77, №5.– P.513–519. 5. Пат. 5071753США, МКИ5 С 12 Ρ 17/04, С 12 Ρ 7/40. Process for enzymatic preparation of organic esters of ascorbicacid or erythorbic acid: Пат. 5071753 США, МКИ5 С 12 Ρ 17/04, С 12 Ρ 7/40 Enomoto Kaheniko,Miymori Takao та ін. – № 607676;  Заявл. 01.11.90; Опубл. 10.12.91.– 3 с. 6. Wong W.C, BasriM.,Razak С.N.A., Salleh A.B. Synthesis of medium-chain glycerides  using lipase from Candida rugosa //JAOCS.– 2000.– Vol. 77, №1.– P.85–88. 7. Maki KC, Davidson MH, Tsushima R, Matsuo N etc. Con-sumption of diacylglycerol oil as part of a reduced-energy diet enhances loss of body weight and fat incomparison with consumption of a triacylglycerol control oil // Am. J. Clin. Nutr.– 2002.– Vol. 76.–P.1230–1236.8. Матеріали фірми "Novozymes".Надійшла до редколегії 10.04.07Рисунок – Зміна концентрації жирних кислот в реакційній суміші.00,511,522,533,50 10 20 30 40 50 60Час, хвилиниКонцентрація жирнихкислот, моль/л

http://repository.kpi.kharkov.ua/bitstream/KhPI-Press/21769/1/vestnik_KhPI_2007_9_Nekrasov_Doslidzhennia.pdf

Дослідження кінетики ферментативної етерифікації

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Library of National Technical University "Kharkiv Polytechnic Institute"

eNTUKhPIIR Electronic National Technical University "Kharkiv Polytechnic Institute"; Institutional Repository