Phycobiliprotein fluorescently labeling immunoassay

Abstract

藻胆蛋白荧光探针灵敏、安全、无污染，作为新一代荧光探针，用于荧光检测有着广泛的应用前景。本文以藻胆蛋白为荧光探针，建立了藻胆蛋白荧光免疫分析检测系统，根据近代模块化、仪器化、智能化的研究开发模式，进行了抗体生产、标记试剂制备、分析方法设计和分析信号检测四个环节的共性、关键性技术研究和优化，为普及型免疫诊断、多组分并行检测及蛋白质芯片的研究开发提供了重要参考，主要工作和结果如下：（1）采用杂交瘤细胞体内诱生法制备单克隆抗体（McAb),也进行了干藻提取藻胆蛋白工艺的探索，得到了符合免疫检测的主要材料。（2）用化学交联法制备藻胆蛋白荧光标记物，确定了流程，进行了流程各步的条件试验和优化，得到了几组异型双功能试剂的优化组合。同时进行了活化剂种类、浓度、配比等的对照试验，结果表明：活化剂S尸DP与RPE的摩尔比以40:1～200:1,反应时间以0.5～3.5 h为宜；以2-IT疏基化McAb时，其优化浓度以2.0～5.0 mm01lL,反应时间以100～150 min为宜。交联抗体的质量优化是一个多因素共同作用的复杂过程，综合考虑交联物的结合比、抗体效价和相对荧光强度，SPDP活化RPE的摩尔比宜取80:1。传统液相制备标记物存在结合位点随机性，导致抗体结合位点被占、屏蔽或空间位阻影响检测灵敏度。为克服此缺点，本文提出了固相交联制备藻胆蛋白荧光标记抗体的新方法：首先将抗原固定化于固相载体，然后将抗体免疫吸附于固相抗原上，此时抗原结合部位受到了保护，再将探针与抗体交联，最后将标记好的抗体从固相抗原上解离下来，固相抗原可重复多次制备标记抗体，所制得的藻胆蛋白荧光抗体标记物活性损失较小，平均标记率1.18，检测灵敏度高。该方法委托国家专利局查新，未见报道。（3）荧光免疫检测对固相载体的形状、荧光背景有着特殊要求，经大量筛选，选择了适宜的固相载体，探索了制备抗体的方法和工艺，分别得到了可供使用的固相抗体。提高其包被率和质量是关键，本文以硝酸纤维素(NC)膜物理吸附制备固相抗体，进行了抗体包被浓度与包被环境（缓冲液配方、浓度、p日）的优化实验，结果得到包被的抗体浓度以1 mg/mL为宜，选用0.01 mol/L, pH 8.0PBS用于包被后，血清样品阴性检出率100%,特异性达1000%、阳性检出率为93.3%；采用本文化学活化工艺制备的活化NC膜连接的抗体蛋白牢固，且有利于抗原、抗体结合，增加了兔疫检测的灵敏度，用于检测60份医院血清样品，阴性检出率100％、特异性100％、阳性检出率为90.7％，与普通膜相比，检出滴度提高了10倍，对低纳克抗原的检出可重复率提高2一3倍。初步探索了固相抗体的稳定性，发现加入适量甘氨酸、Tween 20可延长活性保存期，4“C保存6个月后，固相抗体活性保留率大于90％。④设计及反复实验，建立了藻胆蛋白荧光免疫分析检测流程与方法。通过标记抗体一抗原一固相抗体双位点夹心法，用于乙肝病毒表面抗原的检测，证明是可行的，并己成功用于其它抗原（如前列腺特异性抗原）的检测，表明该法具有普适性。用双抗夹心法时，选择的捕获抗体与标记抗体需严格配对，本文通过实验筛选的配对组合（γ、RPE-助特异性为100％，阳性血清检出滴度达1:32000，灵敏度比实验中最差的配对组合高出130倍。建立了藻胆蛋白荧光免疫一步法，以硝酸纤维素膜为固相载体一步检测，所需时间仅几分钟，用于随机检测500份血清，阴性检出率100%、特异性100%,阳性检出率为96.0％，加之荧光检测结果长期保存无明显衰减，有望形成一种快速、适于分散取样、集中检测的检测方法。建立了二步法优化的规范操作流程，从洗涤条件、引入信号放大系统和封闭条件等多个环节进行调试和优化。如以120 mmol/L PBS (pH7.5),含0.1％Tween 20为洗涤液检测60份医院验血样品，阴性检出率100%,特异性100%,阳性检出率93.3%.将生物素一亲合素标记系统（BAS）用于该系统，通过探针制备、桥式标记和有效封闭等条件优化，简化了检测步骤，提高了检测灵敏度，对于弱阳性血清样品检出率提高了1.5倍。为充分发挥藻胆蛋白荧光特性，又进行了多组分并行检测的探索，实验对H BsAg和PSA双抗原混合样品荧光免疫检测，分辨清晰，可同时测定，表明将藻胆蛋白用于多组分并行检测乃至制备蛋白芯片有望实现