Production and Purification of Recombinant Adenovirus Encoding IkBaM

Abstract

随着基因工程技术的发展，基因治疗尤其是对癌症的基因治疗越来越多地得到人 们的关注。人们构建了各种基因治疗载体，重组腺病毒就是基因治疗的重要载体之一。 293细胞是在重组腺病毒的生产过程中常用的包装细胞之一。能否生产出大量高质量 的腺病毒载体是制约体外实验和临床实验的关键因素。为了满足体外和临床实验的需 要，本论文针对293细胞包装体系生产Ad5-IkBaM重组．腺病毒载体进行了以下几个方的研究。 1、293细胞的生长特性。实验发现293细胞贴壁能力很弱，对乳酸的耐受性很好：对搅拌速度非常敏感，所以，在微载体培养时，接种后前2h采用间歇搅拌，2h后控制搅拌速度在20r／min。 2、摸索了293细胞批式和灌注培养的生长与代谢。在方瓶和搅拌瓶批式（微载体浓度为69／L）培养条件下，检测了葡萄糖、谷氨酞胺和乳酸的代谢。在此基础上设计了间歇式灌注培养的方案，间歇灌注培养最终细胞密度达到了批式培养的三倍。根据293细胞生长特性，在Logistic模型的基础上，建立了描述批式和灌注微载体培养的293细胞生长模型，模型同实验结果符合很好。 3、对Ad5-IkBaaM的生产工艺进行了优化。确定了病毒的最佳接种量为MOI＝8，血清浓度为10％，pH＝7.2，接毒时间为对数生长中后期，接毒后4oh收获病毒。采用MUSTANG Q膜层析系统对重组腺病毒的纯化进行了初步的探讨，该方法有效的减少了纯化的步骤，从而降低了纯化过程中Ad5-IkBaM的损失。 4、为了降低贴壁依赖性细胞规模培养的成本，本论文探索了293细胞培养过程中的Cytodex-3的回收工艺。实验结果表明经回收处理后的微载体可以很好的支持293细胞的生长。比较了细胞在回收的、新的和胰酶处理后的微载体上的生长规律。发现前两者的生长代谢规律十分相似。细胞在胰酶处理后的微载体上的生长则受到了很大的影响