Estudio de las tres fases germinación de las esporas de los antibióticos Streptomyces antibioticus y Micromonospora chalcea: oscurecimiento, hinchamiento y emergencia de los tubos germinativos y del metabolismo de los mismos.Ministerio de Cultur

Barbés Miguel, Covadonga Ludivina

Hardisson Rumeu, Carlos

Manzanal Sierra, Manuel Benjamín

Rodicio Rodicio, María del Rosario

Salas Fernández, José Antonio

Suárez Fernández, Jesús E.

Repositorio Institucional de la Universidad de Oviedo

FISIOLOGIA DE LA GERMINACION EN DOS ACTINOMICETOS: Streptomyces y Micromonospora Por C. BARBES, M. B. MANZANAL, R. RODICIO, J. A. SALAS, J. E. SUAREZ Y C. HARDISSON Departameniti Iiiierfacultaiivo de Microbiología. Universidad de Oviedo RESUMEN La germinación de las esporas d e s .  a n ~ i b i o ~ i c u s  y M. chalcea. transcurre a través d e  tres fases: oscurecimiento, hinchamiento y emergencia d e  los tubos germinativos. La primera fase, oscureci- miento, s e  caracteriza por un descenso d e  la D.O. y una disminución d e  la refringencia; solamente requiere cationes divalentes y la energía necesaria puede obtenerse a partir de las reservas endógenas de la espora. La segunda fase, hinchamiento, necesita una fuente de carbono exógena y no es bloqueada por mitomicina C; en este  estado las esporas presentan una gran actividad metabólica. La última fase, emergencia, requiere fuentes d e  carbono y d e  nitrógeno. La temperatura óptima para la germinaciiin fue 4 5 O C  y 40°C p a r a s .  untibioticus y ¡M. chalceu, respectivamente, y el pH óptimo fue 8 para ambos ~iiicroorganismos. La síntesis d e  macromoléculas siguió el orden ARN, proteína y ADN y fue sensible a inhibidores d e  síntesis d e  macromoléculas. Ambos microorganismos no parecen presen- tar diferencias notables en su germinación, a excepción del metabolismo más lento que  posee M. chalcea. INTRODUCCION Los Actinomicetos son un grupo d e  bacterias en  las cuales a partir d e  una espora asexual se  desarrolla un micelio ramificado; en este micelio posterior- mente se  producirán esporas por tabicación d e  las hifas las cuales una vez maduras y colocadas en condiciones apropiadas repetirán el ciclo. La germina- ción es el proceso por el cual una espora s e  transforma en un organismo vegeta- tivo (CROSS & ATTWELL, 1975). Dentro del orden Actinomicetales s e  encuentran los géneros Streptomyces (productor d e  la mayor parte d e  los antibióticos conocidos) y Micromonospora (productor de  varios antibióticos). Este trabajo presenta un estudio comparativo d e  la fisiología d e  la germi- nación de dos especies de estos géneros: Streptomyces antibioticirs y Micromo- nospora chnlcen. MATERIAL Y METODOS Microorganismos Los microorganismos utilizados en este estudio fueron Streptomyces anti- biotic~rs ATCC* 11891 y Micromonospora chalcea ATCC 12542. Obtención de esporas Ambos microorganismos se  sembraron en matraces de  250 rnl con 75 rnl de medio G.A.E. sólido (glucosa-asparragina-extracto de levadura) (HARDISSON et al. 1978), y se incubaron a 28°C durante nueve días (S. antibiotic~rs) y 20 días (M. chalcea). Pasado este tiempo, a los matraces esporulados se añadieron unas 200 bolas de vidrio estériles de 3-4 rnm de diámetro y se  agitaron los matraces suavemente con el fin de  que las esporas quedasen adheridas a las bolas. Las bolas se  lavaron con solución salina + Tritón X-100 0,025 % y se  filtró la suspensión a través de  papel de  filtro Whatman n.O 1 para eliminar los restos de micelio. El filtrado s e  lavó dos veces mediante centrifugación en solución salina y el sedimento se  resuspendió en el medio adecuado y s e  ajustó la densidad óptica (580 nm) a 0,3 (lo8 esporaslml para S. antibioticus y 3 x lo8 esporaslml para M. chalcea). Cerminación Alicuotas de 10 m1 de  las suspensiones de  esporas fueron incubadas en matraces d e  100 m1 a 35°C y 200 r.p.m. A intervalos de tiempo determinados, se tomaron muestras para determinar su D.O. y para su observación en el microscc- pio de contraste de  fases. Influencia de factores físicos, químicos y nutricionales El efecto de la temperatura sobre la germinación se  estudió incubando matraces de 100 m1 con 10 m1 de suspensión de esporas en medio GAE a distintas temperaturas desde 23 a 55OC, y tomando muestras a distintos tiempos para su observación al microscopio. Para determinar el efecto del pH sobre la germina- ción, los componentes del medio GAE se disolvieron en distintos tampones 0,I  M (GOMORI, 1955) con valores de  pH desde 1 a 10, siguiéndose la germinación mediante toma de  muestras y observación en el microscopio. * ATCC American Type Culiure Collection. 134 El estudio nutricional se  realizó observando el efecto de  cationes divalen- tes, fuente de  carbono y fuente de  nitrógeno sobre la germinación. Los cationes ensayados fueron Ca*, Mg* y Fe*, todos ellos en concentración 0,001 % en agua destilada. Se  ensayaron 14 fuentes de carbono y 20 fuentes de nitrógeno a concentraciones finales 1 % y 0,2 % respectivamente, usando como medio basa1 las sales del medio CAE. Como fuente de  nitrógeno s e  empleó en el primer caso SO, (NH,), y como fuente de carbono glucosa para el segundo caso. La acción de  varios inhibidores sobre la germinación se estudió añadiendo el inhibidor al medio GAE al inicio de la gerrninación y observando su efecto sobre la posterior emisión de los tubos germinativos a las seis horas ( S .  antibioticus) y a las ocho horas ( M .  ch alcea). Determinoción de actividades respiratorio, catalasa y citocromo oxidasa S e  empleó un electrodo de  oxígeno polarográfico tipo Clark. Suspensiones de esporas a concentraciones de  2 x lo8 esporaslml para S .  antibioticus y lo9 esporaslml para M. chalcea, en tampón fosfato 5 mM pH 7,O se  colocaron en la cubeta del electrodo durante tres minutos a 35OC para alcanzar la temperatura del experimento y a continuación se  añadieron los respectivos sustratos. Las mues- tras se  mantuvieron en continua agitación mediante agitación magnética. Los sustratos empleados fueron glucosa 20 mM para respiración, ascorbato sódico 10 mM y NNN'N-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD) 2,5 mM para citocromo oxi- dasa y H,O, 1 mM para catalasa. La actividad citocromo oxidasa se ensayó según el método de JURTSHUK et al. (JURTSHUK, MARCUCCI & MCQUITTY, 1975) y la activi- dad catalasa según el método de  RORTH & JENSEN (1967). Síntesis de macronolécnlas La síntesis de macromoléculas durante la germinación se  estudió por métodos radioactivos y colorimétricos. Por métodos radioactivos s e  estudió la incorporación de  3H-Uridina, 3H-Leucina y 3H-Timina todos ellos en concentra- ción 1 pCilml a RNA, proteína y DNA, respectivamente. A tiempos determinados se sacaron muestras en las que se detuvo la incorporación de elemento radioac- tivo, se  filtraron y se contó la radioactividad precipitada en el filtro en un contador de centelleo. En algunos experimentos la incorporación de elemento radioactivo se determinó mediante pulsos de  3 min (S .  antibioticus) ó 5 min ( M .  chulcea). La cantidad total de macromoléculas durante la germinación se deter- minó por métodos colorimétricos. Las muestras de  esporas (60 m1 de D.O. = 0,3) fueron lavadas y posteriormente rotas en un homogeneizador Braun. El extracto crudo se  hizo 0,25 M con C1 O, H y s e  mantuvo 30 min en baño de hielo. Posteriormente se centrifugó y el sedimento se  extrajo con C10,H 0,5 M a 70°C durante 20 min repitiéndose la operación tres veces. Los sobrenadantes que resultaron se utilizaron para la determinación de RNA por el método de S C H N E I -  DER (1957) y d e  DNA por e l  método d e  BURTON (1956). El sedirnent.0 s e  extrajo con Na OH 1M e n  caliente y el sobrenadante s e  empleó para  la determinación d e  proteínas por el método d e  LOWRY e t  al. (LOWRY, ROSEBROUGH, F A R R  & RANDALL, 1951). RESULTADOS Cambios morfológicos y absorbancin durante la germinación H e m o s  empleado dos métodos para el estudio d e  la gerrninación d e  S. antibioticus y M .  chalcea: a) Recuento  en cámara  Thorna al microscopio d e  contraste  d e  fases  d e  las  distintas fases  morfológicas y b) Variación d e  la densi- dad  óptica. L a s  esporas  durmientes  d e  ambos  actinomicetos presentan un centro claro refringente rodeado d e  una zona más  oscura;  al colocarse en un medio de  germinación la espora oscurece,  poster iormente hincha alcanzándose un máximo d e  esporas  hinchadas a l a s  2 y 5 horas e n  S. antiOiotic~is y M .  chalceu respecti- vamente;  f inalmente tiene lugar  la emergencia  d e  los tubos germinativos. Estos  cambios morfológicos van acompañados d e  variaciones d e  la D.O. (Fig. 1). El oscurecimiento coincide con un descenso  d e  la D.O. (20 y 30 % con respecto al valor inicial e n  S. antibioticus y M .  chalcea respectivamente); posteriormente la DIO. aumenta  con la emergencia  d e  los tubos germinativos. El  peso seco d e  las  esporas  permanece  constante  hasta  e l  momento d e  la emisión d e  los tubos germinativos e n  q u e  comienza a aumentar  progresivamente (Fig. 1). Tiempo de incubaci6n (min) Fig. l.-Variación de  la densidad óptica (e) y el peso seco  í m )  durante la gerrninación. Influencia de factores fisicos, qil,im¿co.s y nl~tricionales a) Temperatura. Los márgenes d e  temperatura entre los cuales germina- ron las esporas fueron 20-50°C para S. antibioticus y 20-45'C para M. chalcea, siendo la temperatura óptima 45OC y 40°C para S. antibioticus y M .  chalcea respectivamente. b) pH. Las esporas germinaron dentro del margen de  pH 6,O-9,s ( S .  nntil>ioticus) y 6,5-11,O ( M .  chalcea) siendo el pH óptimo 8,O para ambos microor- ganismo~. C) Nutrientes. Las esporas de  ambos microorganismos no germinaron en agua destilada, pero oscurecieron con la adición de muy pequeñas cantidades de cationes divalente: S04Mg, S0,Fe y C1,Ca (0,001 %). Para que el hinchamiento tenga lugar e s  necesaria la adición de  una fuente d e  carbono (por ejemplo, glucosa 1 %) y para la emergencia d e  los tubos germinativos son necesarias la presencia simultánea de fuente de carbono y de  nitrógeno. Se  ensayó el efecto de  20 fuentes de nitrógeno (orgánicas e inorgánicas) y de  14 fuentes de  c.bono. En ambos microorganismos hubo compuestos que permitieron una rápida germina- ción, otros que permitían una germinación lenta y otros que no fueron metaboliza- bles. Las mejores fuentes de nitrógeno fueron sales inorgánicas: S0,(NH4),, N0,NH4 y N0,Na y entre los aminoácidos: alanina, prolina, glicina, isoleucina e histidina en ambos microorganismos. Como fuentes de  carbono ambos utilizaron muy bien glucosa y galactosa, siendo también bien empleadas sacarosa y maltosa. d) Inhibidores. La germinación d e  las esporas d e  ambos microorganismos fue sensible a inhibidores respiratorios y desacoplantes d e  la fosforilación oxida- tiva tales como cianuro potásico, atabrina y 2,4-dinitrofenol (todos ellos a concen- tración 1 mM), bloqueándose la germinación en su fase inicial permaneciendo las esporas en estado durmiente. También fue sensible a inhibidores de  síntesis d e  macromoléculas como estreptomicina, rifampicina, cloranfenicol, mitomicina C y actinomicina D, aunque en este caso la inhibición no afecta a la fase inicial u oscurecimiento, permaneciendo las esporas oscuras. e) Variación en actividades enzimáticas y respiración durante la  germi- nación. Las esporas durmientes d e  ambos microorganismos presentan una activi- dad respiratoria baja pero detectable con el electrodo de oxígeno, así como actividades catalasa y citocromo oxidasa. Con la germinación todas estas activi- dades específicas aumentan progresivamente alcanzándose un máximo con el hinchamiento para después disminuir y alcanzar un valor constante (Fig. 2). f) Síntesis de macromoléculas. El orden de  inicio de  la síntesis de macro- moléculas fue el mismo en ambos microorganisrnos determinado tanto por méto- dos radioactivos, como por métodos químicos: ARN, proteína y ADN (Figs. 3 y 4). La síntesis d e  ARN comienza con el oscurecimiento, la de  proteína con el hinchamiento y la de  ADN con la emisión d e  los tubos germinativos. S e  estudió el efecto de  la adición d e  inhibidores d e  la síntesis de  macromoléculas añadidos al S.antibioticus H. chalcea Tiempo de innibaci6n (min) Tiempo de incubacibn (h)  Fig. 2.-Cociente respiratorio (o), ac~ividad catalasa ( A )  y actividad ci~ocrorno oxidas3 1 m )  durante la gerrninación. inicio de  la incubación. En S. antibioticus, la rifampicina y la estreptomicina bloquearon totalmente la síntesis de  las tres macromoléculas, mientras que la mitomicina C solamente bloqueó la síntesis de  ADN. En  M. chalcea la rifarnpi- cina bloqueó la síntesis de  las tres macrornoléculas mientras que estreptornicina y mitornicina C bloquearon tanto la síntesis de  proteína como la de ADN pero no la de  ARN. S.  ant ib io t i cus  o 8 7 , s -  8 3 0 -  -10  - m o o o f m U k a - 8 - i  O - 6 -  0, X E - 4- ,e - <1 I - 2 - . $  2 Gl 40 80 120 160 Tiempo de dncubacidn (min) Tiempo de incubaci6n (min) Fig. 3.-Síntesis de rnacromoléculas determinada por incorporación d e  precursores radioactivos. TNA (o), DNA ( A )  y proteína (m). 8.antibioticus M. chalcea 60 120 180 Tiempo de incubaci6n (min) T S ,  , , , - r  1 3  5 7 9  Tiempo de incubaci6n (h) Fig. $.-Síntesis de  macromoléculas determinada por métodos colorimétricos. RNA (o), DNA ( A )  y proteína ( m  ). DISCUSION La germinación abarca el conjunto de  cambios morfológicos, fisiológicos y bioquímicos por los que las esporas durmientes s e  transforman en células vegeta- tivas. En los Actinomicetos estudiados en este trabajo, el proceso puede dividirse en tres fases: oscurecimiento, hinchamiento y emergencia de  los tubos germinati- vos. El oscurecimiento es un proceso por el cuál las esporas pierden la refringen- cia característica del estado durmiente y consecuentemente se  produce un des- censo en la densidad óptica de la suspensión de esporas, la cual es mayor en M. chalcea que en S .  antibiot icw dada la mayor refringencia de  sus esporas. Para que el oscurecimiento tenga lugar es absolutamente necesario en ambos microor- gan i smo~ la presencia de  cationes, siendo independiente del aporte energético externo, aunque sin embargo es inhibido por inhibidores respiratorios por lo que el proceso requiere energía que las esporas obtienen a partir d e  sus reservas endógenas. Este resultado coincide con el encontrado por ENSIGN (1976) en S. viridochromogenes. Además durante el oscurecimiento no existe síntesis d e  ma- cromoléculas teniendo lugar en presencia de  inhibidores de  estas biosíntesis, aunque una vez las esporas han oscurecido comienza la biosíntesis de  ARN. El oscurecimiento difiere esencialmente del proceso denominado iniciación de  la germinación de  Bacillus ya que éste es un proceso esencialmente degradativo durante el cual se  pierde hasta un 30 % del peso seco de  las esporas (POWELL & STRANGE, 1953). Durante el hinchamiento las esporas aumentan de  diámetro como conse- cuencia de  la hidratación de  su citoplasma, ya que su peso permanece constante, habiéndose postulado que ocurriría como consecuencia de  la hidrólisis controlada de grandes rnacromoléculas citoplásmicas con el consiguiente ,aumento de la presión osrnótica interna (HOHL, 1 9 7 5 ) .  El hinchamiento requiere energía que ha de ser externa en el caso de  S. u.ntibioticus, pudiendo ser endógena durante gran parte del proceso en M. chalcea. Durante este estado las actividades metabólicas d e  las esporas aumentan rápidamente obteniéndose máximas actividades especí- ficas en el momento en que hay un máximo d e  esporas hinchadas y así tanto la respiración como la citocromooxidasa y la catalasa presentan máximo en este punto d e  la germinación. Este resultado está de  acuerdo con el descrito por ~ L A K O U T S K I I  & POUZHARITSKAJA ( 1 9 7 3 )  en Actinomyces streptomycini. La actividad de  biosíntesis de ARN es necesaria para el hinchamiento y así los inhibidores de su síntesis inhiben el proceso. La biosíntesis proteica comienza durante el hin- chamiento por lo que los inhibidores de  su síntesis la retardan severamente. El orden de  biosíntesis de macromoléculas es A R N ,  proteína y ADN. A resultados semejantes han llegado BALASSA & CONTESSE ( 1 9 6 5 )  en Bacil l t~s y MIKLJLIK et al. ' (1977)  en S. granaticolor. Es interesante resaltar que el hinchamiento ocurre en ausencia de  compuestos nitrogenados por lo que  estas biosíntesis han de  ser efectuadas a expensas de  reservas endógenas. Resultados similares fueron halla- dos en Bacillus (GARRICK & TORRIAM, 1973) .  La mitomicina C presentó un efecto diferente en su acción sobre ambos microorganismos ya que en S. antibioticus sólo inhibe la síntesis de  ADN no siendo afectado por tanto el hinchamiento mientras que en M. chalcea posee también efecto sobre la síntesis de  proteínas con lo que el hinchamiento s e  retarda. La emisión de  los tubos germinativos requiere procesos de biosíntesis activa como se  desprende del aumento de  peso seco, siendo necesario aporte externo de fuentes de  carbono y de  nitrógeno; su comienzo coincide con el inicio d e  la síntesis d e  ADN, siendo inhibida por inhibidores de la síntesis de esta macromolécula. Estos resultados coinciden con los descritos por SETLOW & KORN- BERG ( 1 9 7 0 )  en Bacillus y por LOPERFIDO & SADOFF (1973)  en cistos de  Azotobacter. Esta fase de  la germinación es  la única que permite la obtención de  protoplastos por tratamiento con lisozima (RODICIO et al., 1978) .  BALASSA, G. & CONTESSE, A. (1973).-Annales de I'lnsiitut Pasteur, 1 0 9 :  683-705. BURTON, K .  (1956).-Biochemical Journai, 62: 315323.  CROSS, T. 8 ATTWELL, R. W. (1975).-Spores V I ,  3-14. American Society for Microbiology. ENSIGN, J. C. (1976).-Microbiology 1976, 531-533. American Society for Microbiology. GARRICK-SILVERSMITH, L. & TORRIANI, A. 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Fisiología de la germinación en dos actinomicetos : Streptomyces y Micromonospora

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