Micronúcleos e alterações morfológicas em eritrócitos e hepatócitos de espécimes de Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes) quando expostos a um herbicida a base de cianamida hidrogenada

Abstract

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Luiza de Brito Portela CastroDissertação (mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Estadual de Maringá, 2017RESUMO: O ecossistema aquático é quase sempre o destino final para resíduos urbanos, agrícolas e industriais, o que pode afetar a homeostase dos seres vivos que o habitam. O estreito contato dos peixes com o ambiente aquático propicia o movimento de agentes genotóxicos através de muco, pele, brânquias e outras camadas externas ou ainda atingir órgãos internos causando danos muitas vezes irreversíveis. A ação de agentes tóxicos podem também induzir efeitos genotóxicos por afetarem material genético, o que pode ser evidenciado através de aberrações cromossômicas, como quebras cromossômicas ou cromátidicas, perda de cromossomos inteiros ou por condensação de fragmentos cromossômicos (micronúcleos) e, além disso, causar diversos tipos de alterações morfológicas nucleares em eritrócitos. Portanto, o presente estudo visou verificar os efeitos da exposição ao agrotóxico Dormex® sobre os hepatócitos sobre eritrócitos de peixes da espécie Astyanax altiparanae. Neste estudo foram utilizados 65 exemplares de Astyanax altiparanae obtidos a partir de estabelecimentos de comércio de "iscas vivas" para pesca. As concentrações de Dormex® utilizadas foram de 0,05ml, 0,1ml e 0,5ml para 10 litros, com tempos de exposição de 24h, 48h e 72h para análise de eritrócitos e 24h e 48h para análise histológica. Para análise dos eritrócitos, a partir de sangue extraído da veia caudal, foram utilizados 40 animais sendo distribuídos quatro peixes/aquário contendo 10L de água e estabelecendo-se quatro grupos: 1 (controle, cujo aquário continha somente água de clorada e monitorado 24h); 2 (concentração 0,05ml/10L); 3 (concentração 0,1ml/10L) e 4 (concentração 0,5m/10L). Para cada concentração, os peixes foram expostos durante 24h, 48h e 72h. Para os estudos histológicos foram utilizados 25 animais expostos às mesmas concentrações com tempos de exposição de 24h e 48h para cada tratamento. Amostras de fígado foram retiradas após eutanásia dos animais e processadas conforme métodos histológicos rotineiros. Os dados histológicos foram avaliados quanto a sua normalidade pelos testes Komogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk. Dados paramétricos foram submetidos ao teste One-way ANOVA e pós-teste de Tukey e para os dados não-paramétricos foi utilizado o teste Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn’s. A análise dos eritrócitos dos peixes revelou diferentes tipos de alterações morfológicas nucleares e ocorrência de micronúcleos quando expostos às diferentes concentrações de solução de Dormex®. Com relação à presença de micronúcleos, observou-se uma maior freqüência nos três tratamentos (0,05, 01 e 0,5 ml/10L) no período de exposição de 48h totalizando 7 células contendo um micronúcleo. Quanto às alterações morfológicas nucleares foram observados núcleos dos tipos notched, lobed, eightshaped e blebbed. Entretanto, observou-se uma freqüência diferenciada quanto ao tipo de alteração sendo notched e eightshaped as mais frequentes. Com relação aos dados histológicos, os peixes quando expostos à solução de Dormex® na concentração de 0,5ml/10L demonstraram redução na densidade de hepatócitos (p < 0,05) quando comparado aos demais grupos analisados, independente do tempo avaliado. Houve também aumento na área média celular e nuclear de hepatócitos (p < 0,05) nesta concentração ( (0,5ml/10L) e ocorreu um aumento da área nuclear na concentração de 0,05 (ml/L) em relação ao grupo controle. Os dados obtidos no presente estudo revelaram que a presença de agrotóxicos na água, até mesmo em baixas concentrações, como no caso dos tratamentos realizados com o agrotóxico Dormex®, pode causar danos aos tecidos dos peixes. As concentrações utilizadas correspondem às doses subletais permitindo a sobrevivência do animal nos aquários durante o período do experimento, porém quando diluídas em 10 litros de água resultou em uma concentração bem baixa. Contudo, devemos ressaltar que no ambiente a concentração de herbicidas, fluindo para as águas de rios, riachos e/ou córregos próximos aos locais de pulverização das plantações pode ser maior na época da aplicação dos mesmos. No presente estudo os peixes submetidos às diferentes concentrações e tempos da solução de Dormex®, resultaram no total de 63 alterações (presença de micronúcleos e alterações morfológicas nucleares) sugerindo assim sua genotoxicidade. Os danos causados aos peixes foram confirmados pelas alterações na densidade e morfologia dos hepatócitos demonstrando os efeitos negativos do uso indiscriminado destes agrotóxicosABSTRACT: The aquatic ecosystem is almost always the final destination for urban, agricultural and industrial waste, which can affect the homeostasis of the living beings that inhabit it. The close contact of the fish with the aquatic environment facilitates the movement of genotoxic agents through mucus, skin, gills and other external layers, or to reach internal organs, causing damage that is often irreversible. The action of toxic agents can also induce genotoxic effects by affecting genetic material, which can be evidenced by chromosomal aberrations, such as chromosomal or chromatic breaks, loss of whole chromosomes or by condensation of chromosomal fragments (micronuclei) and, in addition, cause different types of nuclear morphological changes in erythrocytes. Therefore, the present study aimed to verify the effects on liver cells and erythrocytes of of fish of the species Astyanax altiparanae when exposure to the Dormex® pesticide by means of histological analyses and erythrocytes through the micronucleus test together with analysis of nuclear morphological changes. In this study, 65 specimens of Astyanax altiparanae were obtained from commercial establishments of "live bait" for fishing. The Dormex® concentrations used were 0.05ml/10L, 0.1ml/10L and 0.5ml/10L, with exposure times of 24h, 48h and 72h for erythrocyte analysis and 24h and 48h for histological analysis. For the analysis of the erythrocytes, from the blood drawn from the caudal vein, 40 animals were used and four fish/aquarium were distributed containing 10L of water and four groups were established: 1 (control, whose aquarium contained only unchlorinated water and monitored 24h); 2 (concentration 0.05ml /10L); 3 (concentration 0.1ml/10L) and 4 (concentration 0.5ml/10L). For each concentration, the fish were exposed for 24h, 48h and 72h. For the histological studies, 25 animals exposed to the same concentrations, with exposure times of 24h and 48h were used for each treatment. Liver samples were removed after euthanasia of the animals and processed according to routine histological methods. Histological data were evaluated for their normality by the Komogorov-Smirnov and Shapiro-Wilk tests. Parametric data were submitted to the One-way ANOVA and Tukey post-test, and for the non-parametric data the Kruskal-Wallis test and Dunn's post-test were used. Analysis of fish erythrocytes revealed different types of nuclear morphological changes and occurrence of micronuclei when exposed to different concentrations of Dormex® solution. With respect to the presence of micronuclei, a higher frequency was observed in the three treatments (0.05, 01 and 0.5 ml / 10L) in the exposure period of 48h totaling 7 cells containing a micronucleus. As for the nuclear morphological changes were observed nuclei of the types notched, lobed, eightshaped and blebbed. However, a distinct frequency was observed as to the type of alteration being notched and eightshaped the most frequent. Regarding the histological data, the fish when exposed to the solution of Dormex® in the concentration of 0.5 ml/10L demonstrated a reduction in hepatocyte density (p <0.05) when compared to the other groups analyzed, regardless of the time evaluated. There was also an increase in the mean cellular and nuclear area of hepatocytes (p <0.05) at this concentration (0.5 ml/10L) and at the concentration of 0.05 ml / L there was an increase in the nuclear area in relation to the control group. In addition to these alterations, nuclear hypertrophy was observed in the groups with the highest concentration (0,5 ml) of the pesticide, independent of time. The data obtained in the present study revealed that the presence of pesticides in the water, even in low concentrations, as in the case of the treatments carried out with the Dormex® pesticide, can cause damage to the fish tissues. The concentrations used correspond to the sublethal doses allowing the survival of the animal in the aquaria during the period of the experiment, but when diluted in 10 liters of water resulted in a very low concentration. However, it should be noted that in the environment the concentration of herbicides flowing into the waters of rivers, streams and/or streams near the crop spray sites may be higher at the time of application. In the present study, fish submitted to the different concentrations and times of the Dormex® solution resulted in a total of 63 changes (presence of micronuclei and nuclear morphological changes), thus suggesting their genotoxicity. The damage caused to the fish was confirmed by the changes in the density and morphology of the hepatocytes demonstrating the negative effects of the indiscriminate use of these pesticides38 f. : il. (algumas color.)