Поліваріантна біотехнологія препаратів-антисептиків на основі мікробних бактеріолізинів

Abstract

Дисертацію присвячено науковому обгрунтуванню та розробці поліваріантної біотехнології різних форм антисептичних препаратів з використанням селекціонованого продуценту бактеріолізинів Streptomyces albus UN 44. Запропонована схема підтримуючої селекції продуценту, проведено комплексний таксономічний аналіз та реідентифікація культури. Вперше встановлена здатність культури до синтезу антифунгальних антибіотиків, які були виділені та ідентифіковані як біс(2-етилгексил)фталат і 3-O- метилциклополова кислота. Модифіковано та оптимізовано склад поживного середовища для біосинтезу бактеріолізинів, що визначило його здешевлення у 1,5-2 рази та підвищення продуктивності культури до 8-9 тис. МО/см3. Обгрунтована доцільність застосування адсорбційного способу для одержання іммобілізованої форми бактеріолітичного препарату з використанням аеросилу та встановлені основні механізми іммобілізації. Розроблені іммобілізований бактеріолітичний препарат з активністю 100 тис. МО/г, рідкий комплексний антисептик Цитал, рідкий та гранульований препарати для рослинництва Стрептофунгін-Фіто, препарати окремих бактеріолізинів ферментного комплексу та препарат антибіотиків Стрептофунгін. Розроблено процеси застосування окремих препаратів у складі композицій побутових та промислових синтетичних мийних засобів, в основі композицій м′яких та рідких форм лікувальних ветеринарних препаратів, а також в процесах отримання біологічно активних компонентів мікробних клітин та в харчовій промисловості.The thesis is devoted to the scientific grounding and development of polyalternative biotechnology of multivariate antiseptic preparations based on bacteriolysin and other antimicrobial products of the selected producer Streptomyces albus UN44 with activity heightened in 4−4,5 times. The scheme of the supporting selection of producers, that includes step treatment with mutagens of different nature (nitrous acid, ultraviolet radiation, N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine) in set effective doses was proposed, and subsequent selection of overproducers. The complex taxonomic analysis of culture was first conducted, with the definition of the nucleotide sequence of 16S rRNA gene and morphological, biochemical and biosynthetic features, that allowed to reidentify the culture as S. albus (initially S. recifensis var. lyticus). The possibility of replacing the hydrolyzed starch to molasses as a part of the nutrient medium for the biosynthesis of bacteriolysins by the selected strain was shown. Using the method of two-factor analysis of variance and central composite rotatable plan, the concentration of these components was optimized, which determined the price reduction of nutrient medium in 1,5-2 times and the increase of the biosynthetic activity of the culture by 30-40%. The increased stability and efficiency of the immobilized form of the bacteriolytic preparation from S. albus UN44 were detected, which was prepared using adsorption on aerosil silica, and the main binding mechanisms in the enzymecarrier system were shown − hydrogen bonds with silanol and OH-groups on the carrier surface, and the electrostatic interactions. The technological parameters of obtaining the immobilized drug were determined and became the basis of the Regulation (PR 20.59-02070987-001:2015) and biotechnology of the bacteriolytic drug Cytorecifen-M, which has been implemented at SE "Enzyme". It was shown, that the antimicrobial action of the immobilized drug is not only useful on clinical strains of pathogens in a state of suspension, but leads to the inhibition (in 8-10 times) and the destruction of P. aeruginosa biomembrane. Stability of the bacteriolytic complex of S. albus UN44 when stored in a liquid phase of culture fluid at a temperature to +10°C and using of the sterilizing filtration has identified the possibility of developing a liquid form of antiseptics. Prospects for the use of this drug in veterinary medicine (and potentially medicine) are caused by the detected harmlessness of the producer, which is attributed to the group of the avirulent microorganisms (IV class of danger). The ability of the culture to synthesize complex antibiotics, which were identified using the matched system of two-stage extraction and fractionation, was detected for the first time. Using the methods of chromatography-mass spectrometry analysis, the main antibiotic compounds of the culture were investigated and identified: bis (2-ethylhexyl) phthalate (C24H38O4) and 3-O-metylcyclopolic acid (C12H14O6) with molecular masses of 390,3 and 254,1 respectively. For obtaining the antibiotics of antifungal and antibacterial specificity, the extraction and fractionation system was chosen, using column chromatography and the eluents, accordingly, chloroform:isopropanol (97:3−80:20) and chloroform or hexane:chloroform (1:1). The determined conditions of allocation of antibiotics were used to develop the technological foundations for obtaining another form of medication-antiseptic from S. albus UN44. For the first time was defined the high antagonistic activity of S. albus UN44 towards relatively common phytopathogenes of genera Bipolaris, Fusarium, Phytium, Rizoctonia, along with the shown growth-stimulating activity determines the feasibility of using one of the developed forms of antiseptics in crop. The culture fluid preparation with a concentration 108−109 CFU/cm3 can be produced in the form of a suspension or dried and granulated form. The immobilized form of the enzyme preparation is used in the development of patented synthetic detergent with antiseptic effect, which is recommended for everyday use and for washing in hospitals. The possibility of the Cytal drug usage was shown in the processes of the food industry for the preparation of bakery improver, that improves the product quality in organoleptic characteristics and the porosity (7%). The mode of biomass degradation of selected lactic acid bacteria cultures using bacteriolysins for obtaining dietary supplements was developed and put into production. The composition of the mild medical form (ointment) was matched, using the Cytal preparation, which contains formative components in certain concentrations (polyethylene, polyethylene glycol, proxanol 268, glycerin), anesthetic (lidocaine), preservative (ofloxacin) and reveals the prolonged antimicrobial action. Based on the research, the technical design for essential equipment and biotechnology of various forms of antiseptic drugs were developed, the normative documentation for the production and recommendations for the use of drugs were approved. Some technologies and processes were tested and put into production, practice and teaching process. The practical significance of the results was confirmed by relevant implementing regulations, recommendations for use and patents.Диссертация посвящена научному обоснованию и разработке поливариантной биотехнологии разных форм антисептических препаратов с использованием селекционированного продуцента бактериолизинов Streptomyces albus UN 44. Предложена схема поддерживающей селекции продуцента, проведен комплексный таксономический анализ и реидентификация культуры. Впервые установлена способность культуры к синтезу антифунгальных антибиотиков, которые были выделены и идентифицированы как бис(2-этилгексил)фталат і 3-O-метилциклополовая кислота. Модифицирован и оптимизирован состав питательной среды для биосинтеза бактериолизинов, что определило снижение его стоимости в 1,5-2 раза и повышение продуктивности культуры до 8-9 тис. МО/см3. Обоснована целесообразность применения адсорбционного способа для получения иммобилизированной формы бактериолитического препарата с использованием аэросила и установлены основные механизмы иммобилизации. Разработаны иммобилизированный бактериолитический препарат с активностью 100 тыс. МЕ/г, жидкий комплексный антисептик Цитал, жидкий и гранулированный препараты для растениеводства Стрептофунгин-Фито, препараты отдельных бактериолизинов ферментного комплекса и препарат антибиотиков Стрептофунгин. Разработаны процессы применения отдельных препаратов в составе композиций бытовых и промышленных синтетических моющих средств, в основе композиций мягких и жидких форм лечебных ветеринарных препаратов, а также в процессах получения биологически активных компонентов микробных клеток и в пищевой промышленности