'Editora da Universidade Federal Rural do Semi-Arido - EdUFERSA'
Abstract
A vitrificação é uma biotécnica reprodutiva em crescimento, sendo considerada um dos métodos de criopreservação para conservação de tecido ovariano. O presente estudo objetivou avaliar os efeitos da vitrificação utilizando o ovarian tissue cryosystem (OTC) e a vitrificação em agulha adaptada (VIA) sobre a viabilidade e morfologia dos folículos ovarianos pré-antrais (FOPAS) inclusos no tecido ovariano de cadelas após o cultivo in vitro. Para tanto, cinco pares de ovários de fêmeas adultas foram coletados, fragmentados, destinados aos diferentes protocolos de vitrificação mencionados. Tanto os fragmentos a fresco (controle) quanto aqueles vitrificados em VIA ou OTC, e posteriormente aquecidos foram submetidos ao cultivo in vitro por 3 e 9 dias. Assim, os fragmentos do grupo controle fresco, controle fresco cultivado por 3 e 9 dias, bem como os grupos criopreservados: OTC aquecido, OTC cultivado 3 e 9 dias, VIA aquecida, VIA cultivada 3 e 9 dias, foram avaliados quanto à viabilidade folicular utilizando azul de tripan 0,4%, classificados como viáveis e inviáveis. Para análise da morfologia folicular, os fragmentos foram fixados em paraformaldeído 4%, destinados a histologia clássica e classificados como primordial, primário ou secundário, bem como em viáveis ou degenerados. Para avaliação tridimensional do tecido, os fragmentos foram fixados em glutaraldeído 2,5%, imersos em tetróxido de ósmio a 1% e desidratados em série crescente de álcoois. Os resultados foram expressos como média e erro padrão. Os resultados foram expressos como média e erro padrão com P < 0,05. Desse modo, obteve-se que o tratamento controle fresco apresentou 77,2 ± 2,81 % (P < 0,05) de viabilidade e não diferiu dos demais, sendo eles controle fresco cultivado por 3 (67,3 ± 6,49 %) e 9 (72,6 ± 1,79 %) dias, além do OTC e VIA aquecidos (85,7 ± 3,58 % e 75,7 ± 2,78 %, respectivamente) e OTC cultivado por 3 (81,3 ± 5,51 %) e 9 (64,6 ± 16,2 %) dias e VIA cultivado por 3 (70,6 ± 4,23 %) e 9 (72,8 ± 7,24 %) dias. Na morfologia, os folículos primordiais não diferiram entre os grupos controle fresco (85,5 ± 7,3%), controle fresco cultivado por 3 dias (81,1 ± 7,0 %), e dos grupos criopreservados aquecidos: OTC aquecido (91,7,0 ± 5,4 %), OTC cultivado 3 dias (52,6 ± 15,4 %), VIA adaptada aquecido (82,1 ± 7,1 %), VIA adaptada cultivado 3 dias (62,7 ± 20,4%) e 9 dias (63,6 ± 6,7 %) (P < 0,05). O controle fresco cultivado por 9 dias (70,1 ± 11,0 %) não diferiu destes nem do grupo OTC cultivado 9 dias (34,1 ± 9,0 %), mas este diferiu dos demais tratamentos (P < 0,05). O mesmo foi observado quanto aos folículos primários, ou seja não diferiu entre os grupos controle fresco (60,1 ± 11,5 %), controle fresco cultivado por 3 (63,6 ± 21,7 %) e 9 (60,7 ± 16,7 %) dias, e dos grupos criopreservados aquecidos: OTC aquecido (73,3 ± 19,4 %), OTC cultivado 3 dias (39,6 ± 15,7%), VIA adaptada aquecido (86,8 ± 6,0 %), VIA adaptada cultivado 3 dias (58,3 ± 30,0 %) e 9 dias (25,0 ± 25,0 %) (P < 0,05). O grupo OTC cultivado sofreu uma queda significativa (P < 0,05) na integridade morfológica, assemelhando-se apenas ao OTC cultivado 3 dias. Não foi observada diferença quanto aos folículos secundários entre os grupos controle fresco (22,9 ± 19,5%), controle fresco cultivado por 3 (15,0 ± 15,0 %) e 9 (20,0 ± 20,0 %) dias, e dos grupos criopreservados aquecidos: OTC aquecido (30,0 ± 20,0 %), OTC cultivado 3 dias (0,0 ± 0,0 %), VIA adaptada aquecido (0,0 ± 0,0 %), VIA adaptada cultivado 3 dias (0,0 ± 0,0 %) e 9 dias (25 0,0 ± 0,0) (P < 0,05). ). Na ultraestrutura, observou-se desorganização das células estromais nos tratamentos OTC cultivado por 3 e 9 dias comparado ao grupo controle fresco e fresco cultivado por 3 e 9 dias. Em conclusão, esse trabalho inova ao mostrar a aplicação do cultivo in vitro para o tecido ovariano de cadelas, sendo sugestivo que a VIA apresenta-se como a técnica mais adequada para vitrificação do tecido ovariano de cadelas em comparação ao OTC, por manter a viabilidade e morfologia folicular.Vitrification is a growing reproductive biotechnique and is considered one of the
cryopreservation methods for conserving ovarian tissue. The present study aimed to evaluate
the effects of vitrification using the ovarian tissue cryosystem (OTC) and adapted needle
vitrification (VIA) on the viability and morphology of pre-antral ovarian follicles (FOPAS)
included in the ovarian tissue of bitches after in vitro culture. vitro. To this end, five pairs of
ovaries from adult females were collected, fragmented, and used for the different vitrification
protocols mentioned. Both the fresh fragments (control) and those vitrified in VIA or OTC,
and subsequently heated, were subjected to in vitro cultivation for 3 and 9 days. Thus,
fragments from the fresh control group, fresh control group cultured for 3 and 9 days, as well
as the cryopreserved groups: heated OTC, OTC cultured 3 and 9 days, heated VIA, VIA
cultured 3 and 9 days, were evaluated for follicular viability. using 0.4% trypan blue, classified
as viable and non-viable. To analyze follicular morphology, the fragments were fixed in 4%
paraformaldehyde, intended for classical histology and classified as primordial, primary or
secondary, as well as viable or degenerated. For three-dimensional tissue evaluation, the
fragments were fixed in 2.5% glutaraldehyde, immersed in 1% osmium tetroxide and
dehydrated in an increasing series of alcohols. The results were expressed as mean and
standard error. The results were expressed as mean and standard error with P < 0.05. Thus, it
was obtained that the fresh control treatment presented 77.2 ± 2.81% (P < 0.05) of compliance
and did not differ from the others, with fresh controls being cultivated for 3 (67.3 ± 6.49 %)
and 9 (72.6 ± 1.79 %) days, in addition to the heated OTC and VIA (85.7 ± 3.58 % and 75.7
± 2.78 %, respectively) and OTC cultivated for 3 (81 .3 ± 5.51 %) and 9 (64.6 ± 16.2 %) days
and VIA cultured for 3 (70.6 ± 4.23 %) and 9 (72.8 ± 7.24 %) days. In terms of morphology,
primordial follicles did not differ between the fresh control groups (85.5 ± 7.3%), the fresh
control group cultured for 3 days (81.1 ± 7.0%), and the heated cryopreserved groups: heated
OTC ( 91.7.0 ± 5.4 %), OTC cultured for 3 days (52.6 ± 15.4 %), VIA adapted heated (82.1
± 7.1 %), VIA adapted adapted for 3 days (62.7 ± 20.4 %) and 9 days (63.6 ± 6.7 %) (P <
0.05). The fresh control cultured for 9 days (70.1 ± 11.0%) does not differ from these nor from
the OTC group cultured for 9 days (34.1 ± 9.0%), but it differs from the other treatments (P <
0.05 ). The same was observed regarding the primary follicles, that is, it did not differ between
the groups fresh control (60.1 ± 11.5%), fresh control cultured by 3 (63.6 ± 21.7%) and 9
(60.7%). ± 16.7 %) days, and of the heated cryopreserved groups: heated OTC (73.3 ± 19.4
%), OTC cultured for 3 days (39.6 ± 15.7%), heated adapted VIA (86.8 ± 6.0 %), adapted
VIA cultivated 3 days (58.3 ± 30.0 %) and 9 days (25.0 ± 25.0 %) (P < 0.05). The cultured
OTC group suffered a significant drop (P < 0.05) in morphological integrity, resembling only
the 3-day cultured OTC. No difference was observed in terms of secondary follicles between
the fresh control (22.9 ± 19.5%), fresh control cultured by 3 (15.0 ± 15.0%) and 9 (20.0 ±
20.0%) groups. ) days, and of the heated cryopreserved groups: heated OTC (30.0 ± 20.0%),
OTC cultured for 3 days (0.0 ± 0.0%), heated adapted VIA (0.0 ± 0.0%) , adapted VIA
cultivated 3 days (0.0 ± 0.0 %) and 9 days (25 0.0 ± 0.0) (P < 0.05). ). In ultrastructure,
disorganization of stromal cells was observed in the OTC treatments cultured for 3 and 9 days
compared to the fresh and fresh control group cultured for 3 and 9 days. In conclusion, this
work innovates by showing the application of in vitro culture to the ovarian tissue of bitches,
suggesting that VIA is the most appropriate technique for vitrification of the ovarian tissue of
bitches compared to OTC, as it maintains viability and follicular morphology.45 f
