Structural and functional characterization of PhzO and TcpA, two members of the two-component flavin-diffusible monooxygenase family

Abstract

Die Globalisierung und die drohende Erschöpfung der wichtigsten natürlichen Rohstoffe zwingen die Menschheit dazu, die Herstellungsprozesse einer wachsenden Anzahl von Produkten zu überdenken. Anhand von zahlreichen Beispielen aus der Natur gelingt es Biochemikern und Biotechnologen in zunehmendem Maße, moderne Herstellungsverfahren für die benötigten Produkte zu entwickeln. Dadurch ist das Feld der Biotechnologie entstanden, die als die Nutzung von lebenden Organismen, einzelnen Enzymen oder Enzymkomplexe in technischen Prozessen durch den Menschen definiert wird. Eine Klasse oft genutzter Enzyme in biotechnologischen Prozessen sind die Monooxygenasen. Diese Enzyme sind an biologischen Abbauprozessen von Xenobiotika und Schadstoffe beteiligt, wie z.B. TcpA aus Cupriavidus necator, sowie bei der Erzeugung verschiedener Verbindungen mit antibiotischen Eigenschaften wie z.B. PhzO aus Pseudomonas aureofaciens. PhzO und TcpA gehören zu der Proteinfamilie der „Two Component Flavine Diffusible Monooxygenases“ (TC-FDM). Das Ziel dieser Studie war es, die Struktur, den Reaktionsmechanismus und die Substratspezifität der Monooxygenasen PhzO und TcpA zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden beide Proteine kloniert, überexprimiert, aufgereinigt, kristallisiert und mittels verschiedener biochemischer und biophysikalischer Verfahren analysiert. Für eine detaillierte strukturelle Charakterisierung der beiden Enzyme wurde die Methode der Röntgenstrukturanalyse verwendet. Zur Untersuchung des Substratumsatzes in den katalysierten Reaktionen wurden APCI-MS-Messungen durchgeführt und die Bindungsaffinität der Enyzme an Substrat und Kofaktoren wurde über ITC-Messungen bestimmt. 6.4.1 PhzO Die Kristallisation von PhzO gelang sowohl im nativen Zustand wie im Komplex mit den Liganden FAD, ADP und FMN. Die nativen Kristalle hatten die Raumgruppe C2221 und zeigten eine Beugung von bis zu 1.7 Å. Das endgültige Modell von nativem PhzO wurde bis zu einer Auflösung von 1.7 Å mit R =18% und Rfree = 20% verfeinert. Die Analyse der Kristalle mit den Liganden ADP und FMN ergab keine zusätzliche Elektronendichte im aktiven Zentrum. PhzO-ADP-Kristalle wurden mittels Co-Kristallisation gezüchtet und anschließend in eine FAD-Lösung eingetaucht, um die Struktur des PhzO-FAD-Komplexes zu bestimmen. Eine Kristallstruktur mit der Raumgruppe C2221 bei 3.2 Å und mit R = 15.8% und Rfree = 20% wurde für diesen Protein-Komplex bestimmt. Die Position des FAD weist darauf hin, dass die Bindung hauptsächlich durch den ADP-Teil erfolgt und dass der Isoalloxazinring nicht an dieser Bindung teilnimmt. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu den ITC-Messungen. Die ITC-Messungen zeigten, dass der Komplex aus PhzO mit FAD durch eine Dissoziationskonstante von 13 μM und eine Reaktionsenthalpie von -4.7 kJ mol-1 charakterisiert ist. Der Isoalloxazinring von FAD ist höchstwahrscheinlich für die Komplexbildung verantwortlich. HPLC-APCI-MS-Messungen haben gezeigt, dass PhzO die Reaktion katalysiert, in der das Substrat PCA zu 2OHPCA umgesetzt wird. Trotz vieler Versuche konnte ein vollständiger Verbrauch des Substrats nicht realisiert werden. Es wird angenommen, dass der Grund dafür die ineffiziente Übertragung des reduzierten Flavins (FADred) aus der Flavin-Reduktase-Komponente (Fre) auf die Monooxygenase (PhzO) ist. Docking- und Modellierungsexperimente mit PhzO- und HpaB-FAD-Proteinkomplex zeigten, dass in PhzO die Aminosäuren R109, T156 bis R166, T202, E263 und R450 bis S461 für die Bindung von FAD zuständig sind. Basierend auf den Kenntnissen über die Struktur von HpaB könnte die korrekte Bindung von FAD in das PhzO zu Konformationsänderungen führen, die das aktive Zentrum für das Substrat PCA zugänglich machen. 6.4.2 TcpA Das zweite in dieser Arbeit beschriebene Enzym wurde in der nativen Form und als Selen-L-Methionin-Derivat kristallisiert. Die Proteinstruktur des nativen TcpAs wurde bei 3.0 Å aufgeklärt und bis auf R = 18% und Rfree = 25% verfeinert. Kokristallisation und soaking-Experimente mit Kofaktor und Substrat scheiterten, sodass eventuelle Komplexbildungen nicht über die Strukturanalyse untersucht werden konnten. Mit den in der wissenschaftlichen Literatur veröffentlichten Strukturen für HpaB, HpaB-FAD und HpaB-FAD-Substrat und mit TcpA wurden Docking- und Modellierungsexperimente durchgeführt, um die Aminosäurereste zu bestimmen, die in TcpA-FAD und TcpA-TCP Komplex-Wechselwirkungen beteiligt sein könnten. So wurde gezeigt, dass die Aminosäuren P156, T192, Q451 an der TCPA-FAD Komplexbildung beteiligt sein könnten