A conservação de pólen é importante para pesquisas básicas, assim como para o intercâmbio e preservação de germoplasma (HANNA, 1994; EINHARDT, 2006; FERES, 2009). O pólen conservado, no entanto, deve preservar sua viabilidade e por isso a necessidade de monitorar essa capacidade antes, durante e depois da conservação. Dessa forma, pode-se estabelecer o período máximo em que os grãos de pólen podem permanecer conservados sem perder a capacidade de germinar e fertilizar, tornando-se dessa forma uma importante ferramenta para o melhoramento e para o intercâmbio entre instituições (DAMASCENO JUNIOR et al., 2008).Melhoramento genético. Resumo n. 266

ALVES, A. A. C.

SANTANA, J. R. F. de

SILVEIRA, T. C. da

SOUZA, F. V. D.

VIEIRA, L. de J.

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CONSERVAÇÃO E LONGEVIDADE DE PÓLEN DE ACESSOS DE ManihotesculentaLívia de Jesus Vieira1, José Raniere Ferreira de Santana2, Thamyres Cardoso da Silveira3, AlfredoAugusto Alves Cunha4 e Fernanda Vidigal Duarte Souza41. Aluna de Doutorado Biotecnologia - Universidade Estadual de Feira de Santana, AvenidaTransnordestina, S/N, 44036-900, Feira de Santana, BA Brasil. liviabiol@gmail.com2. Professor da Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N,44036-900, Feira de Santana, BA Brasil. jose.raniere@gmail.com3 Aluna de graduação - Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, Rua Rui Barbosa, 710,44.380-000, Cruz das Almas, BA, Brasil. thsilveira@gmail.com.4. Pesquisadores da Embrapa Mandioca e Fruticultura , Rua da Embrapa, S/N, 44380-000, Cruz dasAlmas, BA, Brasil. alfredoalves3@gmail.com. fernanda@cnpmf.embrapa.br.IntroduçãoA conservação de pólen é importante para pesquisas básicas, assim como para ointercâmbio e preservação de germoplasma (HANNA, 1994; EINHARDT, 2006; FERES,2009). O pólen conservado, no entanto, deve preservar sua viabilidade e por isso anecessidade de monitorar essa capacidade antes, durante e depois da conservação. Dessaforma, pode-se estabelecer o período máximo em que os grãos de pólen podem permanecerconservados sem perder a capacidade de germinar e fertilizar, tornando-se dessa forma umaimportante ferramenta para o melhoramento e para o intercâmbio entre instituições(DAMASCENO JUNIOR et al., 2008).Dentre as técnicas de conservação, somente a criopreservação (armazenamento emnitrogênio líquido a -196 º C) pode garantir um armazenamento de germoplasma em longoprazo. De acordo com Bajaj (1995), o armazenamento de pólen em nitrogênio líquido, serealizado adequadamente, é capaz de manter sua viabilidade por longos períodos de tempo. Protocolos de criopreservação de pólen de diversas espécies como Mangifera indica,Carica papaya, Carica cauliflora, Citrus limon, Vitis vinifera, Vitis labrusca, entre outras, jáforam estabelecidos (SHIVANNA & SAWHNEY, 1997). O sucesso da conservação do pólen,além do período, depende principalmente de fatores como o estágio fisiológico da flor, atemperatura e umidade relativa do ambiente de armazenamento, e do grau de umidade do grãode pólen (AKIHAMA et al., 1979; GIORDANO et al., 2003). Estudos referentes à produção, morfologia e viabilidade do pólen conservado são,portanto, parte de uma demanda importante no melhoramento genético da mandioca e têmsido foco de estudos (VIEIRA, 2010). Os resultados destes estudos poderão ser aplicados deforma prática viabilizando a realização de cruzamentos de interesse entre mandioca cultivadae espécies silvestres do gênero Manihot  e a geração de novos híbridos com característicassuperiores. Assim, o objetivo deste trabalho foi estimar a viabilidade por testes in vivo ecolorimétrico de grãos de pólen fresco e criopreservados e avaliar a longevidade do pólen demandioca.Material e métodosComo material vegetal utilizou-se acessos de mandioca oriundos do Banco Ativo deGermoplasma (BAG) da Embrapa Mandioca e Fruticultura.Para a realização dos estudos da longevidade polínica, considerou-se pólen fresco e pólenarmazenado, considerando as seguintes condições: 1- pólen armazenado por uma hora; 2 - pólenarmazenado por 24 horas e 3 - pólen crioarmazenado em nitrogênio líquido por 1 hora.Para a realização dos cruzamentos com pólen fresco e armazenados, flores pistiladas eestaminadas foram cobertas com sacos de pano de 20 x 15 cm de comprimento, a fim de protegê-lasda contaminação por pólen exógeno no momento da abertura floral. Foram eliminados frutos, floresestaminadas e flores pistiladas já fecundadas presentes na mesma inflorescência com o auxílio de umatesoura. O pólen foi colhido entre 11:00 da manhã e 14:00 horas, horário já designado como idealpara a realização de cruzamentos (VIEIRA, 2010).A polinização foi alcançada a partir do contato das anteras sobre o estigma da flor pistilada. Aflor foi coberta após a polinização e logo em seguida foi realizada a identificação dos tratamentos como uso de etiquetas contendo informações sobre o nome dos parentais, o número de flores polinizadas ea data da polinização. A viabilidade do pólen, em porcentagem, foi estimada após a contagem donúmero de sementes obtidas pelo número de flores nos cruzamentos, considerando o número de frutosque produziram sementes.Para a estimativa da viabilidade de pólen por meio de testes colorimétricos, os grãos de pólenfrescos e os grãos de pólen armazenados  em nitrogênio líquido foram aspergidos com o auxilio de umpincel sobre lâminas de vidro, onde foi adicionado cinco gotas dos corantes a serem usados: lugol 1%,carmim acético 3% e oceína acética 1%. Após cinco minutos, as lâminas foram levadas aomicroscópio óptico para avaliação.A porcentagem de pólen viável foi estimada pelo número de grãos corados, de tamanho grandeou médio e formato regular. Os dados de viabilidade foram expressos em percentagem, etransformados em arc sen (√ x /100 ), para atendimento das pressuposições da ANOVA. As análisesde variância dos dados foram realizadas pelo programa estatístico SASM Agri (2001). Nos testescolorimétricos o delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 3(condição de armazenamento x corantes) com três repetições, sendo cada repetição formada por 3lâminas com 100 grãos de pólen. As médias foram comparadas pelo teste de Scott knott ao nível de5% de probabilidade.Resultados e discussõesNa Tabela 1 estão os resultados obtidos com o teste de viabiliadde in vivo do pólen fresco edo pólen armazenado em diferentes condições. A viabilidade in vivo de pólen fresco (coletado nomomento da antese), seguido da viabilidade do pólen uma hora após à antese foram os tratamentosque apresentaram maior porcentagem de grãos de pólen viáveis,  com o registro de 70 e 50%  defrutos com sementes, respectivamente. Enquanto que a viabilidade do pólen 24 horas após à antese e aviabilidade do pólen armazenado em nitrogênio líquido por uma hora foi inexistente.Tabela 1. Viabilidade in vivo de pólen fresco, armazenado em temperatura ambiente por uma hora e24 horas e armazenado em nitrogênio líquido por uma hora.Progenitor femininoProgenitormasculinoTratamento Nº de flores Frutos comsementes (%)BGM 540 BGM 358 Pólen fresco 10 70BGM 540 BGM 358 Pólen 1h (27ºC) 10 50BGM 540 BGM 358 Pólen 24h (27ºC) 10 0BGM 540 BGM 358 Pólen 1h (-196ºC) 10 0A maior porcentagem de pólen viável foi registrada no cruzamento realizado com pólenfresco, enquanto a medida que aumentou o tempo de armazenamento registrou-se umcomprometimento da viabilidade e consequentemente dos cruzamentos realizados. Após uma hora dearmazenamento do pólen fresco em temperatura ambiente houve um declínio de 20% da viabilidade eapós 24 horas registrou-se uma perda total de viabilidade polínica. Já Leyton (1993) em estudo deviabilidade do grão de pólen de mandioca após 24 horas e 48 horas obteve a viabilidade de 54% e 480,9%, respectivamente. As diferenças observadas entre os dois trabalhos podem ser devido a váriosfatores, mas principalmente aos genótipos. De qualquer forma a perda de viabilidade em mandiocaparece ser bem marcante logo nos primeiros dias.Ficou registrado também a intolerancia do pólen ao congelamento e a necessidade depre-tratamentos para viabilizar esta opção de armazenamento. Trabalhos com outras espécies mostrama eficiencia da desidratação para a eficiência do ultra congelamento (FRANÇA, 2008; VARGAS,2006).Segundo Scorza e Sherman (1995) um bom pólen deve apresentar 50 a 80% de grãosgerminados com tubos bem desenvolvidos. À medida que o pólen envelhece, a porcentagem degerminação e o comprimento dos tubos polínicos decrescem, comprometendo, dessa forma, afertilização.Não houve diferença significativa entre os diferentes tipos de corantes utilizados, ainda que seregistrou a diferença entre o pólen fresco e o ultracongelado (Tabela 2). Os resultados encontradospor meio dos testes colorimétricos mostram uma falta de correspondência com o que se obteve com afertilização in vivo e deixou, claro a fragilidade deste tipo de avaliação para as variedades estudadas.Tabela 2. Viabilidade (%) dos grãos de pólen de mandioca frescos e criopreservados mediante o usode três corantes distintos. Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na linha e a mesma letraminúscula na coluna pertencem ao mesmo agrupamento ao nível de 5% de probabilidade pelo teste deScott-Knott.Tratamento Carmim acético Lugol Oceína acéticaPólen fresco 90 Aa 94 Aa 94 AaPólen criopreservado 63 Ab 68 Ab 66 AbPor outro lado fica evidente a necessidade de tratamentos de desidratação para acriopreservação eficiente de grãos de pólen destas variedades de mandioca. Provavelmente, aspequenas rupturas na camada externa do pólen, observadas no microscópio podem estar relacionadascom a formação de cristais de gelo e a perda de viabilidade dos grãos de pólen oriundos destetratamento.ConclusãoA ausência de sementes nos cruzamentos e a redução da viabilidade observada nos corantescarmin aécitico, lugol e oceína acética, deixam evidente que o método utilizado para oultracongelamento não manteve a integridade dos grãos de pólen de mandioca.ReferênciasAKIHAMA, T.; OMURA, M.; KOSAKI, I. Long-term of fruit tree pollen and its application inbreeding. Tropical Agriculture Research. v. 4, p. 238-241, 1979.BAJAJ,Y.P.S. Cryopreservation of plant cell. tissue, and organ culture for the conservation ofgermplasm and biodiversity. In: Bajaj, Y. P. S. ed. Cryopreservation of plant germplasm I.Biotechnology in agriculture and Foresty, volume 32, Berlim, Springer, 1995. p. 03-28.CREPALDI, C. I. Biologia da reprodução em Manihot Mill. Campinas, 1987. 160p.DAMASCENO JUNIOR, P. C. et al. Conservação de pólen de mamoeiro (Carica papaya L.). Ceres.Rio de Janeiro. n. 55, v. 5, p. 433-438, 2008EINHARDT, P. M.: CORREA, E. R.: RASEIRA, M. C. comparação entre métodos para testar aviabilidade de pólen de Pessegueiro. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 28, n. 1, p.5-7, 2006.FERES, J. M. Diversidade genética, sistema reprodutivo e fluxo de pólen em duas populações deTabebuia roseo-alba (Ridl.) Sand.: Implicações para a conservação. Dissertação (Mestrado emCiências Biológicas) –Universidade de São Paulo, 2009.FRANÇA, L. V. Secagem e conservação de grãos de pólen de berinjela. 2008. 93f. Dissertação(Mestrado em Ciências Agrárias) - Universidade de Brasília. Faculdade de Ciências Agrárias.Brasília, 2008.GIORDANO, L. B. ARAGÃO, F. A. S., BOITEUX, L. S. Melhoramento genético do tomateiro.Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v. 24, n.219, p. 43-57, 2003.HANNA, W. N. 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Conservação e longevidade de pólen de acessos de Manihot esculenta.

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