AFFONSO, E. G.

CARMO, I. B.

MARCON, J. L.

OLIVEIRA, A. T.

SALES, R. S. A.

SANTOS, M. Q. C.

TAVARES-DIAS, M.

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XVII CONGRESO BRASILEIRO DE ENGENHARIA DE PESCA (COBEP), Belém - PA, 2011.  CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DAS CÉLULAS SANGUÍNEAS DA IRAPUCA (TESTUDINES, PODOCNEMIDIDAE) DO MÉDIO RIO NEGRO, AMAZONAS  Santos1, M. Q. C; Oliveira1, A. T.; Sales2, R. S. A.; Carmo3, I. B.; Tavares-Dias4, M.; Affonso3, E. G.; Marcon2, J. L.  1Programa de Pós-Graduação em Diversidade Biológica da Universidade Federal do Amazonas - Av. General Rodrigo Octávio Ramos, 3000, Campus Universitário, Coroado I, Manaus – AM. E-mail: marcioquara@hotmail.com 2Laboratório de Fisiologia da Universidade Federal do Amazonas - Av. General Rodrigo Octávio Ramos, 3000, Campus Universitário, Coroado I, Manaus – AM 3Laboratório de Fisiologia Aplicado à Piscicultura do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - Av. André Araújo, 2936, Aleixo, Manaus – AM 4Laboratório de Aquicultura e Pesca da Embrapa Amapá – Rod. Juscelino Kubitschek, Km 5, 2600, Macapá – AP   Palavras-chave: hematologia, quelônio, sanidade   INTRODUÇÃO  O acompanhamento das características qualitativas e quantitativas das células sanguíneas constitui uma das maneiras mais elementares para avaliar o estado de saúde dos animais (TAVARES-DIAS e MORAES, 2007). Em mamíferos, as células do sangue são facilmente identificadas com base em suas diferenças morfológicas (PISTOL et al., 2007). Contudo, nos répteis, a identificação destas células ainda é controversa (WORK et al., 1998), sendo que a inconsistência na classificação ocorre em função das diferentes colorações utilizadas e principalmente, pela falta de conhecimento sobre as linhagens celulares desses animais (WORK et al., 1998). Essas informações são mais escassas ainda para as espécies amazônicas da família Podocnemididae (OLIVEIRA-JUNIOR et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2011) e inexistentes para a irapuca, Podocnemis erythrocephala. Esta espécie encontra-se distribuída pelo sul da Colômbia, sudoeste da Venezuela e pela região Norte do Brasil, habitando preferencialmente pequenos rios e lagos de água preta da bacia do Rio Negro, podendo ser encontrada também em ambientes de água clara (MITTERMEIER e WILSON, 1974). De acordo com VOGT (2001), das três espécies de Podocnemis que ocorrem na bacia do Rio Negro, P. erythrocephala é a mais abundante, representando 85% dos quelônios capturados. Entretanto, dentre os podocnemidídeos amazônicos, esta é a espécie menos conhecida do ponto de vista biológico, contribuindo para que fosse classificada pela IUCN como uma espécie vulnerável à extinção (IUCN, 2010).  Este trabalho teve como objetivo identificar e caracterizar morfologicamente as células sanguíneas de P. erythrocephala, gerando informações básicas para futuros trabalhos hematológicos com a espécie.   MATERIAL E MÉTODOS  Foram capturados 15 espécimes de irapuca, de ambos os sexos, com peso (média ± DP) de 442,9 ± 31,5 g e comprimento da carapaça de 17,8 ± 0,4 cm. Os animais foram coletados com auxílio de rede de arrasto em lagos e igarapés do Arquipélago de Mariuá, médio Rio Negro, Amazonas. Em seguida, foram transportados até a Estação de Piscicultura da Coordenação de Pesquisas em Aquicultura (CPAQ/INPA), onde permaneceram em aclimatação em tanques de fibra de vidro por um período de 45 dias. Durante a aclimatação, os animais foram alimentados duas vezes ao dia com vegetais (alface e couve) e com ração para peixe com 32% de proteína bruta, correspondendo a cerca de 5% do peso total dos animais.  Ao final da aclimatação, os animais foram retirados da água e imobilizados através da revirada do corpo do animal. Após total imobilização, a amostra de sangue foi coletada através da punção da veia femoral utilizando seringas banhadas com heparina 5.000 UI e destinada à confecção de extensões sanguíneas.  As análises morfológicas das células do sangue foram feitas em extensões sanguíneas confeccionadas em lâminas de vidro previamente limpas com solução de etanol-éter. Em seguida, as extensões foram coradas com May Grunwald-Giemsa-Wright (Tavares-Dias e Moraes, 2003). Todas as extensões sanguíneas foram analisadas em microscópio óptico XVII CONGRESO BRASILEIRO DE ENGENHARIA DE PESCA (COBEP), Belém - PA, 2011.  Olympus BX51 com câmera acoplada Olympus modelo DP72. As células sanguíneas tiveram o maior e menor diâmetro, bem como a área celular, mensurados com auxílio do programa de análise de imagens CellD. Todas as células foram analisadas quanto aos padrões de forma, tamanho e afinidade tintorial. As identificações e descrições morfológicas foram realizadas com base nos estudos de CLAVER e QUAGLIA (2009), OLIVEIRA et al. (2011) e STACY et al. (2011).   RESULTADOS E DISCUSSÃO  Nas extensões sanguíneas de P. erythrocephala coradas com May Grunwald-Giemsa-Wright (MGGW) foram identificados sete tipos celulares: eritrócitos, trombócitos, linfócitos, azurófilos, heterófilos, eosinófilos e basófilos.  Os eritrócitos (Fig. 1-A) apresentaram tamanho, forma e coloração homogênea, não sendo observadas células irregulares ou com indícios de poiquilocitose. O formato da célula foi tipicamente oval apresentando área de 167,75 ± 23,03 µm2 (Tab. 1). O núcleo foi central e alongado, apresentando pólos arredondados ou irregulares. O maior diâmetro do núcleo foi posicionado paralelamente ao maior diâmetro da célula. No interior do núcleo dos eritrócitos foi observada cromatina densa e com coloração variando do azul ao roxo escuro. Eventualmente foram encontrados eritrócitos infectados por gametócitos de um hemoparasita intraeritrocitário da família Haemogregarinidae, com o núcleo deslocado lateralmente (Fig. 1-A). O citoplasma foi abundante e acidofílico com coloração variando do alaranjado ao rosa.  Os trombócitos (Fig. 1-B) apresentaram área celular inferior às demais células (Tab. 1) e formato variando de elipsóide a circular. O citoplasma foi escasso, sem presença de grânulos e levemente acidofílico com coloração hialina ou rosa claro. O núcleo, disposto no centro da célula, geralmente acompanhou o formato da célula, podendo ser oval ou circular e com cromatina densa e de coloração azul clara a roxa.  Os linfócitos (Fig. 1-C) apresentaram tamanho inferior aos eritrócitos (Tab. 1). O formato variou de circular a amorfo, com citoplasma escasso e basofílico de coloração azul claro, circundando um núcleo largo posicionado centralmente na célula.  Os azurófilos (Fig. 1-D) apresentaram tamanhos e formatos variados com área média de 78,43 ± 18,36 µm2 (Tab. 1). O citoplasma apresentou bordas distintas com coloração característica variando de azul claro a escuro.  Os heterófilos (Fig. 1-E) são células grandes , podendo ser maior que os eritrócitos e com área média de 171,54 ± 30,85 µm2 (Tab. 1). O formato foi predominantemente circular, com citoplasma preenchido por grânulos fusiformes brilhantes de coloração variando de alaranjado a rosa. O núcleo apresentou coloração azul clara, disposição excêntrica e formato redondo ou oval, podendo ocasionalmente ser segmentado.  Os eosinófilos (Fig. 1-E) apresentaram tamanhos variados, mas relativamente menores aos heterófilos, com área média de 139,07 ± 36,37 µm2 (Tab. 1). As células apresentaram formato variando de circular a oval, com citoplasma abundante e preenchido por grânulos circulares acidofílicos com coloração variando de alaranjado a rosa. O núcleo apresentou coloração azul clara, disposição excêntrica e formato variando de circular a oval, podendo raramente ser segmentado.  Os basófilos (Fig. 1-F) apresentaram tamanhos variados, com área média de 113,14 ± 33,06 µm2, sendo encontradas células menores aos eritrócitos e de tamanho semelhante aos heterófilos (Tab. 1). O formato foi predominantemente esférico e raramente oval. O citoplasma foi abundante e preenchido com grânulos esféricos basofílicos de coloração roxa e tamanhos variados. O núcleo circular e excêntrico geralmente foi coberto pelos grânulos citoplasmáticos, dificultando a visualização.  OLIVEIRA-JÚNIOR et al. (2009) estudando o sangue de adultos de Podocnemis expansa, identificaram e caracterizaram sete tipos celulares: eritrócitos, trombócitos, linfócitos, heterófilos, eosinófilos, basófilos e azurófilos. OLIVEIRA et al. (2011), estudando os aspectos morfológicos e citoquímicos das células sanguíneas de recém-eclodidos de P. expansa, P. unifilis e P. sextuberculata, também encontraram os mesmos tipos celulares nas três espécies. As características morfológicas das células sanguíneas de P. erythrocephala foram semelhantes às descritas para as demais espécies de podocnemidídeos. Com exceção dos azurófilos, os demais tipos celulares também foram identificados em outras espécies de quelônios, tais como Caretta caretta (CASAL e OROS, 2007), Mauremys caspica e M. rivulata (METIN et al., 2008) e Ocadia sinensis (CHUNG et al., 2009). Segundo STACY et al. (2011), os azurófilos são variações dos monócitos, existindo apenas em répteis e XVII CONGRESO BRASILEIRO DE ENGENHARIA DE PESCA (COBEP), Belém - PA, 2011.  sendo frequentemente encontrados em squamatas e crocodilianos e, ocasionalmente, em quelônios. Em relação aos leucócitos granulócitos, a presença de eosinófilos, heterófilos e basófilos foi relatada em várias espécies (CASAL e OROS, 2007; METIN et al., 2008; CHUNG et al., 2009; OLIVEIRA-JÚNIOR et al., 2009 e OLIVEIRA et al., 2011). Entretanto, WOOD e EBANKS (1984), CANNON (1992) e PISTOL et al. (2007) relataram a presença de eosinófilos, basófilos e neutrófilos no sangue de Chelonia mydas, Lepidochelys kempi e Phrynops hilarii, respectivamente. Segundo CANFIELD (1998), CLAVER e QUAGLIA (2009) e STACY et al. (2011), os répteis não possuem neutrófilos na corrente sanguínea, sendo os heterófilos funcionalmente análogos aos neutrófilos dos mamíferos. WORK et al. (1998) considera a presença dos neutrófilos nas extensões sanguíneas como artefato e suspeita que os neutrófilos descritos por WOOD e EBANKS (1984) sejam, na verdade, eosinófilos degranulados.  Tabela 1. Diâmetro maior, diâmetro menor e área (média ± desvio padrão) das células sanguíneas de Podocnemis erythrocephala do médio Rio Negro, Amazonas. N = número total de células analisadas. Medições Células N Diâmetro maior (µm) Diâmetro menor (µm) Área (µm2) Eritrócitos 200 18,89 ± 1,50 11,29 ± 1,07 167,75 ± 23,03 Trombócitos 150 15,14 ± 2,47 6,69 ± 0,83 72,11 ± 14,30 Linfócitos 150 12,90 ± 1,79 10,21 ± 1,14 98,43 ± 14,89 Heterófilos 150 15,76 ± 1,68 14,31 ± 1,44 171,54 ± 30,85 Eosinófilos 100 14,84 ± 2,03 12,30 ± 2,02 139,07 ± 36,37 Basófilos 80 12,62 ± 1,86 11,89 ± 1,86 113,14 ± 33,06 Azurófilos 50 11,01 ± 1,43  9,37 ± 1,14 78,43 ± 18,36   Figura 1. Fotomicrografias das células sanguíneas de Podocnemis erythrocephala coradas com MGGW. Eritrócito (A, seta inferior), eritrócito com núcleo deslocado pela presença de hemoparasita (A, seta superior), trombócito (B), linfócito (C), azurófilo (D), heterófilo (E, seta inferior), eosinófilo (E, seta superior) e basófilo (F). XVII CONGRESO BRASILEIRO DE ENGENHARIA DE PESCA (COBEP), Belém - PA, 2011.    CONCLUSÕES O estudo das células sanguíneas de irapuca demonstrou que os podocnemidídeos amazônicos apresentam um padrão conservativo quanto aos tipos celulares e às características morfológicas. Os resultados deste trabalho podem ser aplicados em vários estudos hematológicos com a espécie, norteando a identificação das células do sangue e possibilitando uma avaliação mais precisa do estado de saúde dos animais.   REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS CANFIELD, P.J. 1998. Comparative cell morphology in the peripheral blood film from exotic and native animals. Australian Veterinary Journal, 76: 793-800. CANNON, M.S. 1992. The morphology and cytochemistry of the blood leukocytes of Kemps Ridley Sea turtle (Lepidochelys kempi). Canadian Journal of Zoology, 70: 1336-1340. CASAL, A.B.; OROS, J. 2006. Morphologic and cytochemical characteristics of blood cells of juvenile loggerhead sea turtles (Caretta caretta). 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Caracterização morfológica das células sanguíneas da irapuca (Testudines, Podocnemididae) do Médio Rio Negro, Amazonas.

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