Os desafios impostos ao melhoramento da mandioca (Manihot esculenta Crantz) são grandes e impõem a agregação de novas ferramentas no estudo da variabilidade e da herança a fatores bióticos e abióticos. Neste sentido a incorporação de ferramentas de biotecnologia aos programas tradicionais de melhoramento é uma realidade, para maximizar os ganhos genéticos e os estudos de conservação, diversidade e seleção assistida.Biotecnologia. Resumo n. 124

OLIVEIRA, E. J. de

OLIVEIRA, G. A. F.

SANTOS, V. da S.

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DESENVOLVIMENTO DA TÉCNICA DE TRAP (Target Region Amplification Polymorphism) PARA ANÁLISES GENÉTICAS EM MANDIOCA  Gilmara Alvarenga Fachardo Oliveira(1), Eder Jorge de Oliveira(2) e Vanderlei da Silva Santos(2)  (1)Estudante de Biologia, Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), CEP 44380-000, Cruz das Almas, BA, e-mail: gfachardo@yahoo.com.br; (2)Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura, Rua da Embrapa, s/n, Caixa Postal 007, CEP 44380-000, Cruz das Almas, BA e-mail: eder@cnpmf.embrapa.br; vssantos@cnpmf.embrapa.br                           Introdução  Os desafios impostos ao melhoramento da mandioca (Manihot esculenta Crantz) são grandes e impõem a agregação de novas ferramentas no estudo da variabilidade e da herança a fatores bióticos e abióticos.  Neste sentido a incorporação de ferramentas de biotecnologia aos programas tradicionais de melhoramento é uma realidade, para maximizar os ganhos genéticos e os estudos de conservação, diversidade e seleção assistida.  Diversos tipos de marcadores têm sido utilizados para os estudos moleculares na cultura da mandioca, a exemplo do RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) (Fregene et al., 1997); microssatélites e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Kunkeaw et al., 2010); AFLP, microssatélites genômicos, derivados de EST e SRAPs (Sequence-Related Amplified Polymorphisms) (Chen et al., 2010).  Os diferentes tipos de marcadores exploram polimorfismos em diversas regiões do genoma da mandioca. Contudo, a grande disponibilidade de dados de sequências expressas de DNA tem possibilitado o desenvolvimento de marcadores fisicamente associados a regiões codificantes. Assim, a tarefa de utilizar estas sequências de DNA em estudos de associação com fenótipos de especial importância agronômica depende do desenvolvimento de marcadores moleculares. Neste sentido, a técnica chamada de TRAP (Target Region Amplification Polymorphism) utiliza informações de EST (Expressed Sequence Tags) para gerar polimorfismos relacionados a genes candidatos. Neste caso são combinados iniciadores fixos desenhados a partir das ESTs de interesse com um iniciador arbitrário com um núcleo rico em AT ou GC. Esta técnica possui como vantagens, a alta reprodutibilidade, simplicidade, o acesso a regiões relacionadas a genes e a capacidade de produzir padrão de bandas semelhantes ao da técnica de AFLP (Hu & Vick, 2003). Assim, o objetivo desse trabalho foi otimizar e validar a técnica de TRAP para as mais diversas análises genéticas em mandioca.   Material e Métodos   Foram desenhados 99 iniciadores fixos a partir de sequências EST-alvo obtidas no banco de dados do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Estes iniciadores foram utilizados em reações de PCR (Polymerase Chain Reaction) juntamente com quatro iniciadores arbitrários, constituídos por sequências aleatórias com a região central rica em AT ou CG, com alta afinidade para anelamento em regiões contendo introns ou exons, respectivamente. Para otimização das condições de reação e amplificação desses locos foi utilizado DNA das variedades BRS Jari, Fécula branca e BRS Formosa, sendo estes acessos pertencentes ao Banco Ativo de Germoplasma de Mandioca da Embrapa Mandioca e Fruticultura. O DNA foi extraído utilizando-se o protocolo com CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) descrito por Doyle & Doyle (1987), com algumas modificações.  As reações de amplificação foram otimizadas em volume final de 15 µL, concentração de DNA de 10 ng; 0,2 uM dos iniciadores; 1,0 U de Taq DNA Polimerase; dNTP  0,2  mM; MgCl2   2,0  mM e concentração do tampão de 1X. As amplificações foram feitas em termociclador Veriti®96-well (Applied Biosystems), de acordo com o seguinte programa: 94 ºC por 2 min; 5 ciclos a 94 ºC por 45s, 35º por 45s e 72 ºC por 1 min; seguidos por 30 ciclos a 94 ºC por 45s, 40° por 45s, 72 ºC por 1 min e etapa de extensão final  de 72 ºC por 7 min. Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 2%, com coloração de brometo de etídeo e visualizados sob luz UV.    Resultados e Discussão  Das 396 combinações de iniciadores de TRAP avaliadas, 231 apresentaram polimorfismo nos genótipos analisados (Figura 1). O número total de bandas variou entre 1 e 12 e o número de bandas polimórficas entre 1 e 9 (Tabela 1). Considerando a presença de pelo menos cinco bandas polimórficas, observa-se que de modo geral a combinação dos iniciadores fixos com os aleatórios Arbi1 e Arbi2 apresentaram maior número de combinações altamente polimórficas, 21 e 18, respectivamente. Por outro lado, foram observadas 10 e 2 combinações com o Arbi3 e Arbi4, respectivamente, contendo mais de cinco bandas polimórficas por combinação (Tabela 1).  A percentagem de polimorfismo observada nos marcadores TRAP na análise de apenas três genótipos de mandioca variou de 44,4% (Arbi2+Trap7, Arbi2+Trap43 e Arbi2+Trap27) a 100% (Arbi1+Trap2, Arbi1+Trap8, Arbi1+Trap13, Arbi1+Trap14, Arbi1+Trap16, Arbi1+Trap18, Arbi1+Trap22, Arbi1+Trap34, Arbi1+Trap47, Arbi1+Trap68, Arbi1+Trap98, Arbi2+Trap26, Arbi2+Trap49, Arbi2+Trap70, Arbi2+Trap71, Arbi2+Trap94, Arbi3+Trap75, Arbi3+Trap82 e Arbi4+Trap63). Estes resultados são superiores ao 13 a 16% de polimorfismo observado em trigo (Liu et al., 2005). Como foram utilizados apenas três genótipos para a otimização, vale ressaltar a possibilidade de ser encontrado um número maior de combinações polimórficas promissoras quando os iniciadores forem analisados em um grupo maior de acessos.    Figura 1. Gel de agarose 2% ilustrando o padrão de amplificação obtido para a combinação Arbi2 / Trap 33 ao 46;  M: marcador de peso molécula Ladder 50 pb, J: BRS Jari, F: BRS Formosa e FB: Fécula branca.  Algumas combinações de iniciadores arbitrários permitiram a identificação de polimorfismo nos mesmos iniciadores fixos, a exemplo do Trap2, Trap22, Trap26, Trap39, Trap40, Trap43 e Trap63 (Tabela 2).  De modo geral observa-se para diferentes espécies de plantas que a técnica de TRAP revela múltiplos fragmentos com ótimo padrão de amplificação, para uso nas diversas atividades relacionadas à conservação, caracterização de germoplasma e nos programas de melhoramento. Como o polimorfismo está relacionado a um conjunto de genes candidatos, é possível implementar a caracterização para um conjunto de genes relacionados a diversas rotas metabólicas, muitas delas conhecidas.  Desde que marcadores TRAP foram desenvolvidos, suas aplicações foram direcionadas para acessar variabilidade genética em cana-de-açúcar (Alwala et al., 2006), em fingerprint em cultivares de alface (Lactuca sativa L.) (Hu et al., 2005), e em mapeamento de QTLs (Liu et al., 2005), e identificação dos principais genes de  resistência que controlam ferrugem e antracnose em feijão (Miklas et al., 2006). Portanto, o potencial de uso desta técnica nas diversas etapas dos programas de melhoramento genético de mandioca é alto, pois além de todas as vantagens mencionadas anteriormente o TRAP permite a detecção de polimorfismo em regiões próximas a genes de interesse, o que o torna vantajoso em estudos para identificação de QTLs (Quantitative Trait Loci) ou em estudos de mapeamento associativo, no sentido de acelerar o processo de seleção assistida por marcadores (SAM).  Tabela 1. Características dos 51 Iniciadores considerados promissores, em relação ao número total de bandas (NTB), número de bandas polimórficas (NBP) e percentagem de polimorfismo por marcador. Combinações NTB NBP % pol   Combinações NTB NBP % pol Arbi1+Trap2 9 9 100,00  Arbi2+Trap27 11 5 45,40 Arbi1+Trap8 7 7 100,00  Arbi2+Trap36 11 8 72,70 Arbi1+Trap11 8 5 62,50  Arbi2+Trap37 6 4 66,60 Arbi1+Trap13 6 6 100,00  Arbi2+Trap39 12 7 58,30 Arbi1+Trap14 7 7 100,00  Arbi2+Trap40 5 4 80,00 Arbi1+Trap16 4 4 100,00  Arbi2+Trap43 9 4 44,40 Arbi1+Trap18 7 7 100,00  Arbi2+Trap49 4 4 100,00 Arbi1+Trap20 6 5 83,30  Arbi2+Trap52 5 4 80,00 Arbi1+Trap22 5 5 100,00  Arbi2+Trap70 7 7 100,00 Arbi1+Trap32 5 4 80,00  Arbi2+Trap71 9 9 100,00 Arbi1+Trap34 6 6 100,00  Arbi2+Trap72 6 4 66,60 Arbi1+Trap39 5 4 80,00  Arbi2+Trap89 5 4 80,00 Arbi1+Trap40 7 6 85,70  Arbi2+Trap94 6 6 100,00 Arbi1+Trap43 7 6 85,70  Arbi3+Trap2 5 4 80,00 Arbi1+Trap45 5 4 80,00  Arbi3+Trap22 8 5 62,50 Arbi1+Trap46 6 5 83,30  Arbi3+Trap26 7 4 57,10 Arbi1+Trap47 4 4 100,00  Arbi3+Trap35 5 4 80,00 Arbi1+Trap68 5 5 100,00  Arbi3+Trap44 6 4 66,60 Arbi1+Trap70 5 4 80,00  Arbi3+Trap55 7 5 71,40 Arbi1+Trap73 7 6 85,70  Arbi3+Trap63 5 4 80,00 Arbi1+Trap98 5 5 100,00  Arbi3+Trap75 5 5 100,00 Arbi2+Trap1 6 4 66,60  Arbi3+Trap79 7 4 57,10 Arbi2+Trap5 7 5 71,40  Arbi3+Trap82 4 4 100,00 Arbi2+Trap7 9 4 44,40  Arbi4+Trap43 5 4 80,00 Arbi2+Trap9 6 4 66,60  Arbi4+Trap63 4 4 100,00 Arbi2+Trap26 5 5 100,00            Tabela 2. Iniciadores promissores que apresentaram polimorfismo em diferentes combinações Iniciador fixo      Arbi1 e 2 Arbi1 e 3 Arbi2 e 3 Arbi3 e 4 Arbi1, 2 e 4 Trap2  x    Trap22  x    Trap26   x   Trap39      x     Trap40      x     Trap43     x Trap63       x    Conclusão  A técnica de TRAP permite a seleção de combinações de iniciadores fixos e arbitrários com alto nível de polimorfismo em genótipos de mandioca, que faz deste marcador uma opção promissora na genotipagem de germoplasma e na identificação de genes relacionados a características agronômicas desejáveis, de forma a otimizar os ganhos genéticos nos programas de melhoramento.  Agradecimentos  Ao BID, CNPq e Fapesb pelo apoio financeiro para desenvolvimento da pesquisa.  Referências  ALWALA, S.; SUMAN, A.; ARRO, J.A.; VEREMIS, J.C.; KIMBENG, C.A. Target Region Amplification Polymorphism (TRAP) for assessing genetic diversity in sugarcane germplasm collections. Crop Science, v.46, p.448–455, 2006.  CHEN, X.; XIA, Z.; FU, Y., LU, C.; WANG, W. Constructing a genetic linkage map using an F1 population of non-inbred parents in cassava (Manihot esculenta Crantz). Plant Molecular Biology Reporter, v.28, p.676–683, 2010. DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v.12, p.13-15, 1987. FREGENE, M.; ANGEL, F.; GÓMEZ, R.; RODRÌGUEZ, F.; ROCA, W.; TOHME, J.; ONIERBALE, M.A. A molecular genetic map of cassava (Manihot esculenta Crantz). Theoretical and Applied Genetics, v.95, p.431–441, 1997. HU, J.; OCHOA, O.E.; TRUCO, M.J.; VICK, B.A. Application of the TRAP technique to lettuce (Lactuca sativa L.) genotyping. Euphytica, v.144, p.225–235, 2005. HU, J.; VICK, B.A. Target region amplification polymorphism: a novel marker technique for plant genotyping. Plant Molecular Biology Reporter, v.21, p.289-294, 2003.  KUNKEAW, S.; TANGPHATSORNRUANG, S.; SMITH, D.R.; TRIWITAYAKORN, K. Genetic linkage map of cassava (Manihot esculenta Crantz) based on AFLP and SSR markers. Plant Breeding, v.129, p.112–115, 2010. LIU, Z.H.; ANDERSON, J.A.; HU, J.; FRIESEN, T.L.; RASMUSSEN, J.B.; FARIS, J.D. A  wheat intervarietal genetic linkage map based on microsatellite and target region  amplified polymorphism markers and its utility for detecting quantitative trait loci. Theoretical and Applied Genetics, v.111, p.782-794, 2005.  MIKLAS, P.N.; HU, J.; GRÜNWALD, N.J.; LARSEN, K.M. Potential application of TRAP  (target region amplification polymorphism) markers for mapping and tagging disease resistance traits in common bean. Crop Science, v.46, p.910-916, 2006.  

Desenvolvimento da técnica de TRAP (Target Region Amplification Polymorphism) para análises genéticas em mandioca.

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