Com o intuito de avançar no conhecimento dos mecanismos genéticos envolvidos na tolerância à seca, esse estudo teve como objetivos a identificação de genes diferencialmente expressos em feijoeiro comum sob condições de déficit hídrico, validação via RT-PCT de alguns desses genes-candidatos potencialmente envolvidos na resposta ao estresse, bem como contribuir para o incremento do banco de sequências expressas (EST?s) enriquecidas para genes diferencialmente expressos nos genótipos BAT 477 (tolerante) e Pérola (suscetível) quando submetidos às condições de presença e ausência do déficit hídrico.CONAFE

CARVALHO, P. F. Z.

FARIA, B. M. S. de

GUIMARÃES, C. M.

PAPPAS JUNIOR, G. J.

VIANELLO, R. P.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Identificação e quantificação da expressão de genes diferencialmente expressos sob condição de déficit hídrico em feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris).

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IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO DE GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS SOB CONDIÇÃO DE DÉFICIT HÍDRICO EM FEIJOEIRO COMUM (PHASEOLUS VULGARIS)   BÁRBARA MÜLLER SALOMÃO DE FARIA 1, GEORGIOS JOANNIS PAPPAS JÚNIOR2, CLEBER MORAIS GUIMARÃES3, PATRICIA FERNANDA ZAMBUZZI CARVALHO4 ,  ROSANA PEREIRA VIANELLOMATERIAL E MÉTODOS: O experimento para a obtenção do tecido vegetal utilizado para a extração de RNA total das plantas submetidas e não submetidas ao tratamento de déficit hídrico foi conduzido em condições de casa de vegetação, na Embrapa Arroz e Feijão, no período de junho a agosto do ano de 2008. O RNA total foi isolado a partir de tecido foliar utilizado o produto comercial RNAeasy (Qiagen) e utilizado no desenvolvimento de quatro bibliotecas subtrativas de cDNA baseadas na técnica de Análise de Diferença Representacional (RDA) (LISITSYN et al., 1993). Os fragmentos de cDNA foram clonados e sequenciados via estratégia de Sanger em ABI3100 (Applied Biosystems). A análise pós-sequenciamento foi realizada através da plataforma SisGen (PAPPAS et al., 2008) que avaliou as sequências quanto ao tamanho e qualidade, considerando um número mínimo de 250 pares de base com phred>20, seguido pela análise do nível de redundância das bibliotecas. Os reads exclusivos gerados foram comparados com as sequências do GenBank pelo sistema de análise, integração e disponibilização de dados utilizando o algoritmo nr BLASTx. As sequências exclusivas foram obtidas a partir de análises in silico da presença diferencial entre as bibliotecas e as categorias funcionais atribuídas com base no Gene Ontology. Foram considerados clusters exclusivos sequências com números de reads ≥ 5. A partir de um conjunto de cinco sequências diferencialmente expressas identificadas nos genótipos tolerante e suscetível sob condições de déficit hídrico, denominados de genes-candidatos, foram derivadas primers e sondas fluorescente seguindo o critério padrão definidos para sondas Taqman sintetizados pela Applied Biosystems. Como genes endógenos foram utilizadas as 5   INTRODUÇÃO: O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma leguminosa de consumo humano que se destaca como a mais importante cultivada no mundo inteiro (RAMIREZ VALLEJO; KELLY, 1998). Dentre os fatores climáticos que afetam a agricultura, a seca e a alta temperatura são alguns dos principais problemas para o cultivo do feijoeiro comum e comprometem de modo severo a produção em mais de 1,5 milhões de hectares no mundo (TERAN; SINGH, 2002). A tolerância à seca é uma característica poligênica e envolve mecanismos que atuam de forma isolada ou combinada para evitar ou tolerar períodos de déficit hídrico, o que torna a seca uma característica complexa, de difícil manipulação e compreensão (MULLET; WHITSITT, 1996).  Nesse sentido, diversas ações de pesquisa em todo o mundo estão sendo conduzidas com a finalidade de desenvolver novas variedades de feijão mais tolerantes ao déficit hídrico. O feijoeiro comum é particularmente sensível à deficiência hídrica na sua fase vegetativa de florescimento e de enchimento de grãos (KAVAR et al., 2008). Com o intuito de avançar no conhecimento dos mecanismos genéticos envolvidos na tolerância à seca, esse estudo teve como objetivos a identificação de genes diferencialmente expressos em feijoeiro comum sob condições de déficit hídrico, validação via RT-PCT de alguns desses genes-candidatos potencialmente envolvidos na resposta ao estresse, bem como contribuir para o incremento do banco de sequências expressas (EST’s) enriquecidas para genes diferencialmente expressos nos genótipos BAT 477 (tolerante) e Pérola (suscetível) quando submetidos às condições de presença e ausência do déficit hídrico.                                                              1Bióloga, Mestranda em Genética e Melhoramento, UFV, Viçosa, MG, mullerbsf@gmail.com 2Biólogo, Pesquisador, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia , Brasília, DF, gpappas@cenargen.embrapa.br 3Engenheiro Agrônomo, Pesquisador, Embrapa Arroz e Feijão, Goiânia, GO, cleber@cnpaf.embrapa.br 4Farmacêutica, Pós-doutoranda em Biologia, UFG, Goiânia, GO, patricia.zambuzzi@gmail.com 5Bióloga, Pesquisadora, Embrapa Arroz e Feijão, Goiânia, GO, rosanavb@cnpaf.embrapa.br  sequências do Fator de Elongação 1α (EF1) e rRNA 18S. As amplificações por PCR foram realizadas utilizando reagente padrão para PCR em tempo real, seguido pela leitura das fluorescências em equipamento ABI7500 (Applied Biosystems) e posterior análise dos dados gerados.    RESULTADOS E DISCUSSÃO: O sequenciamento realizado gerou 9.273 sequências, das quais 7.203 foram válidas, totalizando 81% de aproveitamento médio dos clones. A partir de 37% de sequências únicas, o total de contigs e singletons formados foram de 439 e 197, respectivamente. A análise in silico da presença diferencial de sequências entre as bibliotecas revelou 67 sequências exclusivas que podem ser consideras genes-alvo envolvidos na resposta da planta ao déficit hídrico. Dessas, 67% dos genes foram identificados na fase de florescimento, enquanto 43% foram expressos nas condições de enchimento de grãos. Considerando que a fase de florescimento é tida como a mais vulnerável em plantas sob deficiência hídrica, espera-se que a expressão de genes para tentar responder a esse estresse seja maior nessa fase e os resultados obtidos corroboram tal hipótese. Em relação às 67 sequências exclusivas, 55% apresentaram similaridade com sequências obtidas sob condições de estresses bióticos e abióticos, sendo que foram identificas sequências homólogas a 32 espécies diferentes de vegetais com predomínio do grupo das leguminosas. Ao todo, foram atribuídas 10 categorias funcionais às sequências exclusivas, com destaque para a categoria de metabolismo representada por 25% e 18% das sequências da biblioteca Pérola, fase de enchimento de grãos e fase de florescimento, respectivamente, e estimativas de 23% e 30 % para o genótipo BAT 477 nas fases de enchimento de grãos e florescimento, respectivamente. As sequências dessa categoria estão relacionadas a produtos gênicos que mantém processos de síntese e degradação de moléculas, e também permitem o crescimento e reprodução celular, adequando respostas ao ambiente. Assim, muitos desses produtos gênicos estão relacionados a respostas à seca, para que a célula evite ou tolere o estresse. A quantidade de sequências exclusivas com funções desconhecidas e de genes que ainda não foram diretamente relacionados à tolerância a seca foi representada por 45%. Nesse sentido, estudos futuros precisam ser conduzidos a fim de atribuir função biológica aos genes expressos, bem como para ampliar o entendimento dos mecanismos gênicos que potencialmente integram a vias metabólicas das respostas e adaptação do feijoeiro comum em condições de déficit hídrico. Dentre os cinco genes avaliados quanto à expressão diferencial via RT-PCR em tempo real foram avaliados um fator de transcrição denominado DREB (Dehydration Responsive Element Binding Protein) responsivo a desidratação, uma proteína induzida por auxinas, uma proteína responsiva ao estresse oxidativo, componente do aparelho fotossintético e uma proteína com função desconhecida, porém com elevados nível de expressão diferencial entre os genótipos contrastantes na condição de déficit hídrico. A partir da verificação das curvas de amplificação definiu-se um limiar de detecção na faixa de amplificação exponencial distinto para cada gene testado e os valores expressos em ∆CT utilizando os endógenos para normalização. Os resultados indicaram alteração na expressão de genes. O fator de transcrição responsivo a desidratação apresentou expressão aumentada no genótipo tolerante em condições de seca na parte aérea da planta, correspondendo ao esperado na resposta do gene DREB. A proteína repressora de auxina apresentou índices elevados de expressão também no genótipo tolerante, porém no tecido radicular. Para a proteína componente do aparelho fotossintético observou-se expressão elevada somente para o genótipo tolerante na presença e ausência do déficit hídrico. Para os demais genes, níveis diferenciais de expressão foram observados no genótipo suscetível, Pérola, nas condições de presença e ausência de estresse.    CONCLUSÕES: Esse estudo possibilitou gerar um amplo número de sequências derivadas de transcritos expressos sob condição de déficit hídrico obtidas a partir de genótipos contrastantes para a tolerância ao estresse de seca. Tais sequências representam alvos potenciais para serem validadas via análise de expressão gênica diferencial e, com base nessa análise, cinco genes-alvos foram avaliados no presente estudo e a expressão dos genes foi detectada em parte aérea e raiz. Os genes associados ao fator de transcrição responsivo a desidratação, estresse oxidativo e indução por auxina apresentaram níveis diferencias de expressão no genótipo tolerante e representam um avanço no detalhamento dos mecanismos genéticos envolvidos na resposta ao déficit hídrico.  REFERÊNCIAS   KAVAR, T.; MARAS, M.; KIDRIC, M.; SUSTAR-VOZLIC, J. & MEGLIC, V. Identiﬁcation of genes involved in the response of leaves of Phaseolus vulgaris to drought stress. Mol Breeding. v. 21, p. 159–172, 2008.  LISITSYN, N.; LISITSYN, N. & WIGLER, M. Cloning the Differences Between Two Complex Genomes. Science. v.259, p. 946-951,fev,1993.  MULLET, J. E. & WHITSITT, M. S. Plant cellular responses to water deficit. Plant Growth Regulation. v. 20, p. 119-124, 1996.  PAPPAS, G. J. Jr.; MIRANDA, R. P.; MARTINS, N. F.; TOGAWA, R. C.; COSTA, M. M. C. SisGen: A CORBA Based Data Management Program for DNA Sequencing Projects. Lecture Notes in Computer Science. v. 5109, p. 116-123, 2008.  RAMIREZ-VALLEJO, P.1 & KELLY, J. D. Traits related to drought resistance in common bean. Euphytica. Netherlands. v. 99, p. 127–136, set., 1998.  TÉRAN, H.; SINGH, S. P. Comparison of Sources and Lines Selected for Drought Resistance in Common Bean. Crop Science, v.42, p. 64-70, 2002. 

Identificação e quantificação da expressão de genes diferencialmente expressos sob condição de déficit hídrico em feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris).

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