CARNEIRO, N. P.

COELHO, M. R. R.

MARRIEL, I. E.

MOTA, F. F.

PAIVA, E.

ROSADO, A. S.

SELDIN, L.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

Diversidade de Paenibacillus spp. na rizosfera de quatro cultivares de sorgo plantadosem solo de Cerrado sob condições contrastantes de nitrogênioMarcia R.R.Coelho1*, Fabio Faria da Mota1, Ivanildo E. Marriel2, Edilson Paiva2, AlexandreS. Rosado1, Lucy Seldin1 & Newton P. Carneiro21 Instituto de Microbiologia – UFRJ & 2 EMBRAPA-CNPMS; *marciarrc@ufrj.brPalavras chaves: Rizosfera de sorgo, Adubo nitrogenado, Paenibacillus, rpoB e DGGERevisão bibliográficaEntre as 68 espécies do gênero Paenibacillus, nove (P. polymyxa, P. durus,P. graminis, P. macerans, P. borealis, P. odorifer, P. wynnii,P. brasilensis, e P. peoriae) possuem estirpes com habilidadede fixar o nitrogênio atmosférico [1, 2]. São bactérias devida livre que habitam o solo e a rizosfera de diversasplantas e, além de fixarem o nitrogênio atmosférico, algumasestirpes podem influenciar o crescimento e a saúde de plantasatravés da produção de fitormônios, quitinases, proteases,antibióticos e da solubilização do fosfato [3, 4, 5]. Estudostêm mostrado que a rizosfera de várias plantas nãoleguminosas, especialmente da família Poaceae, é colonizadapor um ou mais gêneros de diazotróficos de vida livre,incluindo estirpes de Paenibacillus [3, 4]. Apesar daquantidade de nitrogênio fixado por diazotróficos de vidalivre ser pequena, quando comparada aos diazotróficossimbiontes, microrganismos de vida livre estão presentes namaioria dos solos e algumas vezes podem representar uma fonteimportante de nitrogênio [6, 7].O sorgo (Sorghum bicolor) é uma cultura importante noBrasil devido a sua alta produtividade de grãos e a largautilização como ração animal. Esta planta se desenvolve bemnos meses com menor disponibilidade de chuvas, e essacaracterística faz desta planta uma cultura ainda maispromissora para o nordeste do Brasil. Diferentes cultivares desorgo tem sido desenvolvidos pela EMBRAPA-CNPMS na tentativade reduzir a utilização do adubo nitrogenado. Dentre 400cultivares de sorgo plantados em solo de Cerrado com altos ebaixos níveis de nitrogênio, 24 cultivares foram consideradoseficientes por atingirem o crescimento máximo e nãoapresentarem os sintomas característicos da falta denitrogênio (amarelamento das folhas e baixo crescimento). Osdemais cultivares foram considerados ineficientes pornecessitarem de altos níveis de nitrogênio para crescerem bem.O gene rpoB, que codifica a subunidade • da RNApolimerase, foi escolhido para este estudo pois estudos jácomprovaram a utilidade do uso deste gene em experimentos detaxonomia e diversidade de Paenibacillus em solo e rizosferade plantas [8, 9]. Nesta abordagem, problemas relacionados amúltiplas cópias do gene que codifica o rRNA 16S emPaenibacillus podem ser evitados e, além disso, os perfis deDGGE são menos complexos e mais fácies de se analisar do queos obtidos com fragmentos de rDNA 16S.Neste estudo foram utilizados quatro cultivares de sorgo,dois considerados eficientes (IPA 1011 e FBS 8701-9)  e doisineficientes (IS 5322-C e IS 6320).  Os cultivares foramplantados em solo de Cerrado com altos e baixos teores denitrogênio, 12 kg/ha e 120 kg/ha respectivamente. Noventa diasapós o plantio as amostras foram coletadas e a diversidade depopulações de Paenibacillus foi avaliada através de métodosmoleculares como PCR-DGGE e biblioteca de clones com base nogene rpoB.  Assim pretende-se demonstrar se existe ou não umainfluência do cultivar e da quantidade de nitrogênio aplicadono solo na composição das populações de Paenibacillus.Materiais e MétodosCultivares de sorgo e condições experimentais: Quatro cultivares de sorgo foramcultivados, sendo dois eficientes (IPA 1011 e FBS 8701-9) e doisineficientes (IS 5322-C e IS 6320), em solo de Cerrado (EMBRAPA-CNPMS, Sete Lagoas, MG) e submetidos a níveis contrastantes de adubação nitrogenada, 12kg/ha e 120 kg/ha. As amostras foram coletadas na época defloração, 90 dias após o plantio, e mantidas a -20ºC até a extração deDNA.Extração de DNA e PCR-DGGE: Amostras de DNA foram extraídas utilizando-se okit para extração de DNA do solo “Fast DNA Spin kit for soil” (Qbiogene, BIO 101 Systems,CA, USA). O DNA obtido foi primeiramente amplificado com os iniciadores rpoB1698f erpoB2041r para a amplificação das seqüências do gene rpoB.Para a amplificação das seqüências de rpoB de Paenibacillusfoi utilizado um sistema de PCR “ semi-nested” . Os produtosgerados na amplificação de seqüências de rpoB foram utilizadoscomo molde para uma segunda reação de amplificação utilizando-se os iniciadores rpoB1698f + o grampo de GC em conjunto comrpoBPAEN como descrito por Mota et al. [10] gerando um produtode aproximadamente 280 pb. Estes produtos foram entãosubmetidos a um gel de DGGE para a obtenção dos perfis dacomunidade de Paenibacillus com base no gene rpoB. Algumasbandas foram retiradas do gel, reamplificadas e seqüenciadas.As seqüências obtidas foram identificadas usando-se BLAST-N(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) com o banco de dados Genbank.Comparação dos perfis das comunidades: Os padrões de bandas obtidos no gel deDGGE foram comparados através do software NT-SYS (versão 2.02, Exeter Software,Setauket, NY), utilizando UPGMA (“Unweighted pair group with mathematical averages”) eo coeficiente de DICE.Clonagem e sequenciamento dos produtos de PCR: Os produtos de PCR rpoB docultivares IPA1011 e IS 5322 foram clonados no vetor pGEM-T (Promega,Madison, WI, USA) e transformados em células competentes de E. coli JM109. Apresença do inserto de tamanho correto nos clones foiverificada utilizando-se os iniciadores M13f e M13r. Os clones selecionadosforam seqüenciados usando-se os iniciadores M13f e M13r  em um seqüenciador automáticoABI Prism 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). As seqüências parciais dogene rpoB obtidas foram comparadas às presentes no Genbank usando BLAST-N paraidentificar as seqüências de rpoB mais próximas existentes.Análises estatísticas: Os dados dos perfis de DGGE foram plotadosnuma matriz de presença e ausência de bandas no gel através doprograma Molecular Analyst software (version 1.61; Bio-Rad),utilizando UPGMA (“Unweighted pair group with mathematical averages”) e o coeficiente deDICE. A análise da biblioteca de clones foi feita pelo cálculo do índice de cobertura.Resultados e DiscussãoOs resultados obtidos pela análise em gel de DGGEmostraram perfis que apresentavam uma clara diferença entre oscultivares porém não entre o tratamento com nitrogênio (Figura1). Além disso, nenhuma correlação entre os dois cultivareseficientes e os dois ineficientes pode ser observada (Figura1b), sugerindo que o tipo de cultivar é responsável pelasdiferenças observadas nas populações de Paenibacillus. As setebandas retiradas do gel (Figura 1a) foram identificadas comsendo relacionadas a P. graminis (banda A), P. odorifer(bandas B, C e D), P. durus (bandas E e F) e P. campinasensis(banda G).Uma biblioteca de clones também foi construída com base nos fragmentos de rpoBgerados a partir das amostras de dois cultivares diferentes (IPA1011 e IS5322-C) crescidoscom alta e baixa concentração de nitrogênio no solo. Foram obtidos 318 clones, e após aanálise das seqüências, estas foram agrupadas em 14 espécies de Paenibacillus. Considerandosomente o primeiro “hit” no BLAST-N feito com seqüências de rpoB, os clones obtidosmostraram-se próximos às espécies P. graminis (61%), P. amylolyticus (15%) e P. macerans(13%). As outras 11 espécies foram representadas por poucos clones nas bibliotecas (Tabela1).  A espécie P. graminis predominou em todas as bibliotecas, principalmente na do cultivarineficiente IS5322-C plantado com baixo teor de nitrogênio. Uma maior diversidade deespécies de Paenibacillus foi observada no cultivar eficiente IPA1011 com baixo teor denitrogênio. Seis espécies identificadas nas bibliotecas são consideradas espécies fixadoras denitrogênio.As análises estatísticas das seqüências mostraram que as quatro bibliotecas de clonesobtidas neste estudo cobriram pelo menos 96.2% da diversidade total (Tabela 2). O PCA dasbibliotecas mostrou que a diversidade bacteriana foi mais influenciada pelo cultivar do quepelo nível de nitrogênio aplicado (Figura 2), corroborando os dados obtidos no DGGE.ConclusãoOs resultados encontrados mostram a importância do cultivar na seleção depopulações de Paenibacillus. Foi possível observarmos que o nível de nitrogênio utilizadocomo fertilizante parece não influenciar significativamente na distribuição de populações dePaenibacillus, sendo o tipo de cultivar o fator que mais influenciou a estrutura da comunidadede Paenibacillus presente no habitat estudado. Entretanto, mais estudos são necessários parase avaliar não somente a diversidade estrutural deste gênero, mas também a diversidadefuncional.Referências[1] Coelho, M.; von der Weid, I.; Zahner, V. & Seldin, L. (2003) FEMS Microbiol. Lett. 222,243-250.[2] Rodriguez-Diaz, M.; Lebbe, L.; Rodelas, B.; Heyrman, J.; De Vos, P. & Logan, N. A.(2005) Int J Syst Evol Microbiol. 55, 2093-2099.[3] Seldin, L.; Rosado, A.; Cruz, D.; Nóbrega, A.; Van Elsas, J. & Paiva, E. (1998) Appl.Environ. Microbiol. 64, 3860-3868.[4] Mavingui, P. & Heulin, T. (1994) Soil. Biol. Biochem. 26, 801-803.[5] Rosado, A. & Seldin, L. (1993) World J. Microbiol. Biotechnol. 9, 521– 528.[6] Bürgmann, H.; Meier, S.; Bunge, M.; Widmer, F. & Zeyer, J. (2005) Environ. Microbiol.11, 1711-1724.[7] Kanungo, P.; Kamakrishnan, B. & Rao, V. (1997) Biol. Fertil. Soils. 25, 103-108.[8] Lovell, C.; Friez, M.; Longshore, J. & Bagwell, C. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67,5308-5314.[9] Mota, F.; Gomes, E.; Paiva, E.; Rosado, A. & Seldin, L. (2004) Lett. Appl. Microbiol. 39,34– 40.[10] Mota, F.; Gomes, E.; Paiva, E. & Seldin, L. (2005) FEMS Microbiol. Ecol. 52, 317-328. rpoB PAEN Coefficient Dice 0.40 0.55 0.70 0.85 1.00             IPA1011 N1a   IPA1011 N2a   IPA1011 N1b   IPA1011 N2b   IS5322-C N1a   IS5322-C N2b   IS5322-C N1b   IS5322-C N2a   FBS8701-9 N1a   FBS8701-9N1b   FBS8701-9 N2a   FBS8701-9N2a   IS6320 N1a   IS6320 N1b   IS6320 N2a   IS6320 N2b  Figura 2: Plotagem tridimensional das quarto populações de Paenibacillus (bibliotecas doscultivares IPA1011 e IS5322-C plantados em baixos e altos teores de nitrogênio) testadospela Analise de Componente Principal (PCA).ABCDEFG            IPA1011         FBS8701-9          IS6320             IS5322-C     M   baixo N  alto N  baixo N alto N  baixo N  alto N  baixo N alto N   MCultivar           Cultivar            Cultivar           CultivarABFigura 1: (A) Perfis de DGGE da comunidade de Paenibacillus das rizosferas dos cultivaresIPA1011, FBS8701-9, IS6320 e IS5322-C plantados com baixos e altos teores de nitrogênio.Os traços representam as réplicas. As setas indicam as bandas que foram seqüenciadas. Umfragmento de rpoB de Paenibacillus durus P3L5T foi usado como marcador (M).  (B)Dendrograma mostrando os níveis de similaridade da comunidade de Paenibacillus presentenos cultivares IPA1011, FBS8701-9, IS6320 e IS5322-C plantados com baixos e altos teoresde nitrogênio. O dendrograma foi construído pelo método de UPGMA e pelo coeficiente deDICE. O numero 1 representa baixos teores de nitrogênio (12 Kg/ha) e o número 2 representaaltos teores de nitrogênio (120 Kg/ha), letras a e b representam as réplicas.Tabela 2: Análise estatística das bibliotecas de clones. a E (cultivar IPA 1011) + N =  cultivareficiente plantado em solo de Cerrado com baixos teores de nitrogênio (12 Kg/ha); E - N =cultivar eficiente plantado em solo de Cerrado com altos teores de nitrogênio (120 Kg/ha); I(cultivar IS 5322-C ) + N = cultivar ineficiente plantado em solo de Cerrado com baixosteores de nitrogênio; I - N = cultivar ineficiente plantado em solo de Cerrado com altos teoresde nitrogênio. b Índice de Shannon-Wiener c Evenness, d Índice de cobertura.Tabela 1: Numero de clones identificados como sendo do gênero Paenibacillus, obtidos dasquartros bibliotecas (cultivares IPA1011 e IS5322-C plantados em baixos e altos teores denitrogênio).a (E - N) cultivar eficiente plantado em solo de Cerrado com baixos teores denitrogênio (12 Kg/ha); b  (E + N) cultivar eficiente plantado em solo de Cerrado com altosteores de nitrogênio (120 Kg/ha); c (I - N) cultivar ineficiente plantado em solo de Cerradocom baixos teores de nitrogênio; d (I + N) cultivar ineficiente plantado em solo de Cerradocom altos teores de nitrogênioEspécies dePaenibacillusIPA1011(E - N) aIPA1011(E + N) bIS5322-C(I - N) cIS5322-C(I + N) dP. graminis 30 41 65 59P. amylololyticus 21 10 8 10P. macerans 8 19 2 11P. thiaminolyticus 5 0 0 0P. pabuli 4 0 0 0P. durus 3 6 1 0P. favisporus 1 0 0 0P. dentritiformis 2 0 0 0P. campinasensis 1 4 0 0P. odorifer 2 0 0 0P. curdlanolyticus 1 1 0 0P. sanguinis 0 1 0 0P. peoriae 0 1 0 0P. polymyxa 0 0 1 0total 78 83 77 80Cultivares /fertilizante nitrogenadoaShannon-Wienerb Evenness c Cobert dE+N 1.437 0.691 0.964E-N 1.764 0.735 0.962I+N 0.757 0.689 1.000I-N 0.586 0.364 0.974

Diversidade de Paenibacillus spp. na rizosfera de quatro cultivares de sorgo plantados em solo de cerrado sob condições contrastantes de nitrogênio.

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