FARIAS NETO, J. T. de

MOURA, E. F.

RAMALHO, G. F.

SAMPAIO, J. E.

SILVA, D. T. da

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

DUPLICATAS NO BANCO DE GERMOPLASMA DE MANDIOCA DA EMBRAPAAMAZÔNIA ORIENTAL DETECTADAS POR MARCADORESMICROSSATÉLITESElisa Ferreira Moura1, João Tomé de Farias Neto1, Girena Fernandes Ramalho2, Diehgo Tuloza daSilva3, José Edson Sampaio41Pesquisador A, Dr. em Genética e Melhoramento, Embrapa Amazônia Oriental, e-mail:elisa@cpatu.embrapa.br; tome@cpatu.embrapa.br.2Graduanda em Ciências Biológicas, UFPA, Bolsista ITI-A CNPq, e-mail: girenaufpa@yahoo.com.br3Biólogo, e-mail: dbiotuloza@hotmail.com4Assistente A, Engenheiro Agrônomo, Embrapa Amazônia Oriental, e-mail:edsons@cpatu.embrapa.br.IntroduçãoA base do BAG de mandioca mantido no Pará são materiais provenientes de propriedades deagricultores familiares do Estado. Atualmente, o BAG conta com 470 acessos, incluindo acessos demandioca brava, mandioca doce ou macaxeira e mandioca açucarada. Os acessos vêm sendocaracterizados quanto a 39 descritores morfo-agronômicos previamente estabelecidos (FUKUDA &GUEVARA, 1998). A partir dessa caracterização, vem-se verificando que alguns acessos, inclusivecom denominações diferentes e coletados em diferentes locais, são morfo-agronomicamentesemelhantes, podendo se constituir em duplicatas. A identificação de duplicatas em bancos degermoplasma é interessante para reduzir o tamanho do banco, o que facilita e dinamiza o seu manejo.A principal forma de se identificar duplicatas é pela genotipagem molecular, já que osmarcadores moleculares representam porção do genoma que não sofre influência ambiental, além deamostrar regiões aleatórias do genoma. Os marcadores microssatélites, pela grande quantidade deinformação que geram por loco, vêm sendo utilizados na identificação de duplicatas em bancos degermoplasma e populações de diferentes espécies (ROBICHAUD et al. 2006, van TREUREN et al.2010). Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi genotipar molecularmente acessos de mandiocaidentificados como morfo-agronomicamente semelhantes usando marcadores microssatélites.Material e MétodosForam selecionados 36 acessos do Banco de Germoplasma de Mandioca da EmbrapaAmazônia Oriental, dos quais 41 pares de acessos apresentavam semelhança morfo-agronômica, eforam divididos em 13 grupos de semelhança (Tabela 1). Os acessos selecionados continham 16amostras de macaxeiras ou mandioca doce, diferenciados pela letra “M” e 20 amostras de mandiocabrava. Nos grupos de semelhança em que foram coletados acessos no mesmo município, os mesmosforam coletados em propriedades diferentes. O DNA genômico total foi extraído pelo método deDOYLE & DOYLE (1990) com modificações a partir de folhas jovens. O DNA foi quantificado emgel de agarose a 1%, usando amostras de DNA do fago lambda em diferentes concentrações comopadrões. O DNA foi diluído para 10ng.l-1. Foram utilizados 15 primers microssatélites: GAGG05,GA21, GA126, GA131 e GA136, desenvolvidos por CHAVARRIAGA-AGUIRE et al. (1998) eSSRY04, SSRY09, SSRY19, SSRY20, SSRY21, SSRY63, SSRY82, SSRY102 e SSRY106,desenvolvidos por MBA et al. (2001) para ter maior probabilidade da identificação de duplicatas.Asreações de PCR foram preparadas para volume final de 20 l. Os produtos da amplificação foramseparados em eletroforese vertical, usando gel de poliacrilamida a 6%. Os géis foram revelados comnitrato de prata e escaneados para análise das imagens. Foi realizada a interpretação visual dos géis,onde cada primer representou um loco e cada banda com diferente padrão de migração nos géis foiconsiderada um alelo. As análises foram realizadas no programa Genes (CRUZ, 2001) considerando oíndice ponderado para marcadores co-dominantes/multialélicos para obtenção das dissimilaridades. Amatriz de dissimilaridades foi utilizada para gerar o dendrograma pelo método UPGMA.  Foicalculado o coeficiente de correlação cofenética (CCC) entre a matriz de similaridades genéticas e amatriz dos valores cofenéticos, para verificar a consistência dos agrupamentos. Com a freqüência dosalelos obtida para cada loco, foi calculada a probabilidade de identidade genética, que é aprobabilidade de que dois indivíduos ao acaso compartilhem o mesmo genótipo com os locosutilizados (PAETKAU & STROBECK, 1994).Resultados e DiscussãoAlta variabilidade genética foi encontrada para os acessos de mandioca avaliados. Os 15 locosmicrossatélites utilizados foram 100% polimórficos e amplificaram ao todo 75 alelos, com média decinco alelos por loco. O número de alelos variou de dois (GAGG05 e SSRY102) a oito (SSRY04). Aheterozigosidade média esperada, uma medida de diversidade genética, variou de 0,80 (GA131) a 0,45(SSRY102), com média de 0,66.  A heterozigosidade média observada também foi elevada (0,63), oque costuma ser comum em mandioca, pela sua característica de geração de novos genótipos porreprodução cruzada e propagação vegetativa.A distância genética entre os acessos de mandioca variou de 0,0 a 0,82, com média de 0,57. Odendrograma gerado (CCC=0,92**) não evidenciou a formação clara de grupos de acordo com o tipode mandioca (macaxeira ou mandioca brava), o que geralmente é observado em trabalhos dedivergência genética de mandioca (ELIAS et al. 2004, PERONI et al. 2007).A partir da genotipagem com microssatélites, foram encontrados 34 pares de duplicatas, queapresentaram perfis multilocos idênticos e conseqüentemente, distância genética 0,0. A probabilidadede que dois indivíduos apresentem o mesmo perfil genético com os 15 locos utilizados e asfreqüências alélicas obtidas foi de 7,45x10-13. Ao se retirar os genótipos duplicados, a probabilidadede identidade aumentou um pouco para 7,86x10-13.Tabela 1. Dados de local e ano de coleta dos acessos de mandioca coletados. A letra M. (demacaxeira) indica os acessos de mandioca doce. Grupo desemelhançaCódigo no BAG Nome comum Local de coleta Ano decoleta1 CPATU 162 M. Saracura-BA Estado da Bahia 1995CPATU 021 M. Saracura Desconhecido 19502CPATU 019M. Manteiga –PA Ilha do Mosqueiro, PA 1950CPATU 183M. Manteiga –APPedra Branca do Amapari,AP 19963 CPATU 023 M. Olho Preto desconhecido 1950CPATU 147 M. Viseu Viseu, PA 1994CPATU 122 M. 25-APPedra Branca do Amapari,AP 1993CPATU 177 M. Bahia Ferreira Gomes, AP 1996CPATU 376 05 M. Bahia Moju, PA 2002CPATU 448 M. Pretinha Terra Alta, PA 20094 CPATU 057 M. Peruana Alenquer, PA 1970CPATU 009 Hamburguesa desconhecido 1947CPATU 366 M. Itu Belém, PA 20025 CPATU 193 Maranhense Bragança, PA 1996CPATU 397 Prova D'água Acará, PA 2005CPATU 029 Tapioqueira Belém, PA 19606 CPATU 033 Boi 1 Santarém, PA 1960CPATU 317 Boi  2 Belterra, PA 2001CPATU 083 Boião 1 Santarém, PA 1986CPATU 305 Boião  2 Santarém, PA 20017 CPATU 339 M. Curuai Santarém, PA 2001CPATU 340 M. Lulu Santarém, PA 20018 CPATU 255 CAS 36.9 Santa Bárbara, PA 2000CPATU 143 Maniçobeira Belém, PA 19949 CPATU 069 M. Amarela Santana do Araguaia, PA 1970CPATU 070 M. Amarela 2 Santana do Araguaia, PA 197010 CPATU 261 Pretinha Paragominas, PA 2000CPATU 459 Manivão Bragança, PA 2009CPATU 285 Pacajá 1 Paragominas, PA 2000CPATU 457 Pacajá  2 Bragança, PA 200911 Ainda sem id Milagrosa Igarapé-Açu, PA 2009CPATU 357 Duquinha Castanhal, PA 200112 CPATU 458 Tumase-PA Bragança, PA 2009CPATU 124 Tumase-AP Oiapoque, AP 199313 CPATU 404 Sebastiana Santa Maria do Pará, PA 2005CPATU 013 Jurará Belém, PA 1947A análise mostrou várias situações: confirmações de materiais com o mesmo nome quepossuem o mesmo genótipo, materiais com o mesmo nome que são diferentes e materiais com nomesdistintos que possuem o mesmo genótipo. Entre os materiais identificados como duplicatas, estãomateriais que foram coletados em épocas bem distintas, como os genótipos Sebastiana e Jurará. Oacesso Sebastiana foi coletado em 2005, enquanto o acesso Jurará foi coletado em 1947, ambos noEstado do Pará. Há outros exemplos no estudo, como as variedades Maranhense, Prova d’água eTapioqueira e seis materiais de macaxeiras, materiais com distância igual a 0,0 entre cada par. Entreesses seis materiais de macaxeira, do grupo 3 (Tabela 1), dois foram coletados no Estado do Amapá,enquanto os demais foram coletados em diferentes locais do Pará. Isso confirma a natureza de troca demateriais entre diferentes agricultores, e que influencia a pouca estruturação geográfica dos genótiposde mandioca (ELIAS et al. 2004, SIQUEIRA et al. 2009).  Ao contrário, também houveram variedades que mantiveram suas denominações ao longo dosanos e em diferentes locais de coleta, como a Pacajá e as macaxeiras Manteiga e Saracura.    A identificação de duplicatas em bancos de germoplasma pode estar relacionada ao fato dastrocas de propágulos entre agricultores de diferentes regiões ser comum, em especial quando a plantatem importância econômica. No novo local, aquele genótipo deve receber uma nova denominação,causando confusão nas coletas e armazenamento dos acessos nos bancos de germoplasma.Figura 1: Dendrograma (CCC=0.92**) gerado pelo método UPGMA e baseado nasdistâncias genéticas entre 36 acessos de mandioca genotipados com 15 marcadoresmicrossatélites. Conclusões O estudo mostrou a ocorrência de duplicatas em um banco de germoplasma de mandiocaconstituído principalmente por etnovariedades coletadas na Região Norte do Brasil, e evidenciou aocorrência de materiais específicos espalhados por diferentes localidades da região. A identificaçãodessas duplicatas será de extrema utilidade no manejo do BAG, e também para a seleção devariedades para testes avançados no campo, já que se evitará análise de materiais idênticos.Referências BibliográficasCHAVARRIAGA-AGUIRRE, P.P.; MAYA, M.M.; BONIERBALE, M.W.; KRESOVICH, S.;FREGENE, M.A.; TOHME, J.; KOCHERT, G.  Microsatellites in cassava (Manihot esculentaCrantz): discovery, inheritance and variability. Theoretical and Applied Genetics, v.97, p.493-501,1998.CRUZ, C.D. Programa Genes: aplicativo computacional em genética e estatística. Viçosa: EditoraUFV, 2001. 648 p.DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v.12, p.13-15, 1990.ELIAS, M.; MUHLEN, G.S.; MCKEY, D.; ROA, A.C., TOHME, J. Genetic diversity of traditionalSouth American landraces of cassava (Manihot esculenta Crantz): an analysis using microsatellites.Economic Botany, v.52, p.242-25, 2004FUKUDA, W.M.G.; GUEVARA, C.L. Descritores morfológicos e agronômicos para acaracterização de mandioca (Manihot esculenta Crantz), Cruz das Almas: Embrapa – CNPMF,1998, 38p.MBA, R.E.C.; STEPHENSON, P.; EDWARDS, K.; MELZER, S.; NKUMBIRA, J.; GULLBERG,U.; APE, K.; GALE, M.; TOHME, J.; FREGENE, M. Simple sequence repeats (SSR) markers surveyof the cassava (Manihot esculenta Crantz) genome: towards an SSR-based molecular genetic map.Theoretical and Applied Genetics, v.102, p.21-31, 2001.PAETKAU, D.; STROBECK, C. Microsatellite analysis of genetic variation in black bearpopulations. Molecular Ecology, v.3, p.489–495, 1994.PERONI, N.; KAGEYAMA, P.Y.; BEGOSSI, A. Molecular differentiation, diversity, and folkclassification of “sweet” and “bitter” cassava (Manihot esculenta) in Caiçara and Caboclomanagement systems (Brazil). Genetic resources and crop evolution, v.54, p.1333-1349, 2007.ROBICHAUD, R.; GLAUBITZ, J.C.; RHODES JR., O.E.; WOESTE, K. A robust set of black walnutmicrosatellites for parentage and clonal identification. New Forests, v.32, p.179-196, 2006.SIQUEIRA, M.V.B.M.; QUEIROZ-SILVA, J.R.; BRESSAN, E.A.; BORGES, A.; PEREIRA, K.J.C.;PINTO, J.G.; VEASEY, E.A. Genetic characterization of cassava (Manihot esculenta) landraces inBrazil assessed with simple sequence repeats. Genetics and Molecular Biology, v.32, p.104-110,2009.VAN TREUREN, R.; KEMP, H.; ERNSTING, G.; JONGEJANS, B.; HOUTMAN, H.; VISSER, L.Microsatellite genotyping of apple (Malus x domestica Borkh) genetic resources in the Netherlands:application in collection management and variety identification. Genetic Resources and CropEvolution, v.57, p.853-865, 2010.

Duplicatas no Banco de Germoplasma de mandioca da Embrapa Amazônia Oriental detectadas por marcadores microssatélites.

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