A mandioca (Manihot esculenta Crantz) apresenta elevada diversidade genética concentrada principalmente na América Latina e Caribe. Aproximadamente 8.500 acessos são mantidos em bancos de germoplasma em varias coleções espalhadas mundialmente, dos quais 7.500 encontram-se na América do Sul. No Brasil, cerca de 4.132 acessos já foram coletados e estão sendo mantidos em bancos de germoplasma em vários locais do País.Biotecnologia. Resumo 71

FERREIRA, C. F.

LEDO, C. A. da S.

SILVA, P. H.

SOUZA, R. M. S

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Uso de marcadores RAPD e SSR na detecção de acessos duplicados de mandioca (Manihot esculenta Crantz).

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1USO DE MARCADORES RAPD E SSR NA DETECÇÃO DE ACESSOSDUPLICADOS DE MANDIOCA (Manihot esculenta Crantz) Ferreira, CF1,, Souza, RMS.2,   Silva, PH.3, Ledo, CAS11Pesquisadora da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, S/N, CP 007, 44380-000 Cruz das Almas-BA. Tel: (75)-3621-8061, Fax: (75)-3634-8097, Laboratorio de Virologia e Biología Molecular. E-mail:claudiaf@cnpmf.embrapa.br/ledo@cnpmf.embrapa.br.2Universidade Estadual do Maranhão, UEMA - Cidade Universitária Paulo VI – Caixa Postal 09–São Luís-MA.Tel:  (98)-3245-5461, Fax: (98)-3245-5882, Curso de Biologia.5Universidade Federal de Lavras, UFLA, CP 3037, Lavras, MG, telefone: (35) 3829-1122. E-mail:p p h s i l v a @ h o t m a i l . c o mINTRODUÇÃOA mandioca (Manihot esculenta Crantz) apresenta elevada diversidade genética concentradaprincipalmente na América Latina e Caribe. Aproximadamente 8.500 acessos são mantidos em bancosde germoplasma em varias coleções espalhadas mundialmente, dos quais 7.500 encontram-se naAmérica do Sul.  No Brasil, cerca de 4.132 acessos já foram coletados e estão sendo mantidos embancos de germoplasma em vários locais do País. A Embrapa Mandioca e Fruticultura, sediada em Cruz das Almas – BA, possui o maior Bancode Germoplasma de Mandioca (BAG)-Mandioca do Brasil, com 1300 acessos em campo, numa áreatotal de 3 ha.  As principais atividades desenvolvidas no banco compreendem a coleta, conservação,caracterização, avaliação, documentação e intercâmbio, servindo de apoio para os principaisprogramas de melhoramento da cultura no país.A mandioca é uma espécie altamente heterozigótica, cuja forma principal de propagação évegetativa. A identificação de duplicatas é considerada um passo importante no desenvolvimento deuma coleção nuclear capaz de representar com confiabilidade, a variabilidade genética disponível daespécie, otimizando a melhor condução dos trabalhos pelos melhoristas e tornando o germoplasmamais acessível a todos os seus usuários.Embora o banco de germoplasma de mandioca da Embrapa Mandioca e Fruticultura seja omaior do Brasil, o mesmo vem enfrentando dificuldades devido ao elevado custo de manutenção emdecorrência da limitação de mão-de-obra e ataque de pragas e doenças.  Outro agravante é aocorrência de acessos duplicados, que até o presente vem sendo avaliada apenas por característicasmorfológicas, podendo gerar dúvidas.  O custo para se manter um acesso de mandioca em nível decampo, por ano, está em torno de U$ 17.66 e in vitro, U$ 24.70 (Epperson et al. 1996).Portanto, o principal objetivo do trabalho foi identificar, em caráter preliminar, duplicatasentre sessenta e um acessos de mandioca pertencentes ao BAG-Mandioca, já caracterizadosmorfologicamente, utilizando-se marcadores do tipo RAPD e SSR de forma a viabilizar a manutençãodos acessos representativos do banco e com isso viabilizar as tarefas de armazenamento e intercâmbiode materiais entre instituições nacionais e internacionais.2MATERIAL E MÉTODOSMaterial genéticoSessenta e um acessos de mandioca provenientes do BAG-Mandioca da Embrapa Mandioca eFruticultura foram utilizados na identificação de acessos duplicados.  Esses acessos já haviam sidoseparados em grupos de acordo com descritores morfológicos.Extração e amplificação de DNA genômicoA extração de DNA foi feita a partir de folhas jovens de 61 acessos de mandiocaanteriormente separados em grupos de acordo com as características morfológicas seguindo ametodologia descrita por Doyle & Doyle (1990).  As amplificações seguiram a metodologia propostapor Williams et al. (1990). Os fragmentos de RAPD foram avaliados em gel de agarose a 1,5% e osfragmentos amplificados via SSR foram separados em gel desnaturante de poliacrilamida a 5% esubmetidos à coloração com nitrato de prata segundo o método descrito por Creste (2001).Avaliação dos dados moleculares e eliminação de duplicatasApenas as bandas polimórficas mais nítidas foram utilizadas no estudo.  As bandas foramcaracterizadas como presença (1) e ausência (0). Os dados foram compilados para uso no softwareGENES (Cruz, 2003) para cálculo da dissimilaridade genética utilizando o índice de Jaccard.Procedeu-se então ao cálculo da matriz híbrida, ou seja, utilizando-se os dados morfológicos e demarcadores de DNA (RAPD e SSR) simultaneamente.  Esta matriz foi obtida pelo programa R,utilizando-se o algoritmo de GOWER (Gower, 1971). As distâncias genéticas foram utilizadas pararealizar o agrupamento dos genótipos pelo método UPGMA (unweighted pair-group methodaverages) por meio do programa Statistica 7 e o desvio padrão calculado de acordo com ametodologia proposta por Fu et al. (2006).  Os acessos considerados mais similares de acordo com osdados da matriz de dissimilaridade foram separados e as matrizes de dissimilaridades recalculadasapós cada eliminação de um dos acessos, tendo sempre o cuidado de checar o índice de diversidadegenética (gene diversity) utilizando-se o software POWERMARKER (Liu & Muse, 2005) para nãoprejudicar a variabilidade disponível para os melhoristas. A matriz de distância com base nos dadosdas variáveis multicategóricas (Cole-Rodgers, 1997) foi calculada utilizando-se o programa GENES(Cruz, 2003). O dendrograma calculado com base nesta matriz utilizando-se o software MEGA – 4(Tamura et al. 2007),RESULTADOS E DISCUSSÃO   Atualmente o Banco de Germoplasma de Mandioca da Embrapa Mandioca e Fruticulturaconta com 1300 acessos, representando o maior banco de mandioca do Brasil. Da coleção de trabalho,3aproximadamente 40 acessos são os mais utilizados dentro do programa de melhoramento genético dacultura, demonstrando que há muito material ainda a ser avaliado para poder fazer parte desta coleçãoe contribuir para a ampliação da base genética da cultura.              A caracterização molecular para fins de eliminação de acessos duplicados em bancos degermoplasma é uma atividade que vem crescendo a cada dia; principalmente em virtude dosbenefícios trazidos em termos de custo e manutenção dos mesmos (Virk et al, 1995; Fu et al, 2003;Van Hintum et al., 2003; Chiorato et al., 2006; Fu, 2006). O principal desafio é conseguir identificaros acessos duplicados, redundantes, eliminá-los e manter a variabilidade genética dentro do banco degermoplasma.A dissimilaridade entre acessos por meio de marcadores de DNA pode ser medida a partir dasmédias das dissimilaridades (Chiorato et al., 2006, Hintum, 2003).              Foram caracterizados molecularmente 61 acessos do BAG-mandioca da Embrapa Mandioca eFruticultura. Esses acessos foram escolhidos por estarem devidamente já caracterizadosmorfologicamente de acordo com os principais descritores para a cultura e, portanto sendoconsiderados possíveis duplicatas dentro de seus grupos baseando-se apenas nos dados morfológicos.Primeiramente procedeu-se à análise mais detalhada dos dados morfológicos para verificar aseparação feita dos 61 acessos em 20 grupos. demonstrou que os acessos continuaram agrupados nosseus respectivos grupos; demonstrando boa precisão na avaliação morfológica dos acessos.Avaliação molecular utilizando-se marcadores RAPD e SSRs                      Os 61 acessos foram então caracterizados molecularmente utilizando-se marcadores do tipoRAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e SSRs (Simple Sequence Repeats). Oito primers deRAPD da série Operon Technolgies (Alameda, CA, USA) geraram 85 bandas polimórficas. Os quatroprimers SSR utilizados foram disponibilizados pelo CIAT (Centro Internacional de AgriculturaTropical-Cali-Colombia).  Estes quatro primers geraram 18 bandas polimórficas, perfazendo um totalde 102 bandas polimórficas analisadas.O número de bandas polimórficas por primer de RAPD variou de 5 bandas para o primerOPQ-8 a 17 bandas para o primer OPQ-18.   Em relação aos marcadores SSR, o número de alelosvariou de 3 para o primer SSRY-34 a 5 para o primer SSRY-63.                                                          A matriz de distância genética considerando os dados dos marcadores RAPD e SSR foi obtidautilizando-se o índice de dissimilaridade de Jaccard (Jaccard, 1901) e o programa GENES (Cruz,2003), sendo que os dados foram computados como ausência (0) e presença (1).        Com base nos dados moleculares, os acessos pertencentes ao grupo 1 continuaram próximos,bem como os dos grupos  14, 12, 16 e 17. Entretanto, a maioria dos acessos mostrou uma associaçãodiferente da feita apenas com as características morfológicas, demonstrando a importância dacomplementação da avaliação morfológica com a molecular. 4Procedeu-se então ao cálculo da matriz híbrida, ou seja, utilizando-se os dados morfológicos ede marcadores de DNA (RAPD e SSR).  Esta matriz foi obtida pelo programa R, utilizando-se oalgoritmo de GOWER (Gower, 1971).                         A validação dos agrupamentos foi determinada pelo coeficiente de correlação cofenético(Soka e Rohlf, 1962), calculada pelo programa R e foi r = 0,73, valor acima de 0,5, indicando boaprecisão e construiu-se o dendrograma com os dados híbridos.           Essa matriz híbrida forneceu os dados para os cálculos das dissimilaridades médias entre osacessos.  A dissimilaridade média variou de 0,2644 a 0,3512, com valor de média geral de 0,3028 edesvio padrão de 0,0151. Isto significa que os acessos com valores de dissimilaridade média abaixo de0,2877 (0,3028 – 0,0151 = 0.,877) podem ser considerados redundantes. Portanto, os acessos demandioca que podem ser retirados do banco por serem redundantes encontram-se na Tabela 2. Estes14 acessos representam aproximadamente 20% do total de acessos analisados.Embora os acessos do grupo I, por exemplo, que se permaneceram unidos em todas asanálises; tanto para a análise com dados morfológicos, quanto para moleculares e a em conjunto, adiferença de dissimilaridade média dentro do grupo variou de 0,2913 a 0,3030, não sendo suficientepara eliminar quaisquer componente do grupo. Isto porque a dissimilaridade média em relação a todosos acessos foi de 0,3028 com um desvio padrão de 0,0151 e nenhum acesso deste grupo apresentoudissimilaridade média em relação aos outros acessos menor que 0.2877.  Isto demonstra a importânciade se analisar os dados da matriz de dissimilaridade e não apenas a disposição dos acessos nodendrograma, que certamente levaria a crer que pelo menos 5 a 6 acessos do grupo 1 seriamconsiderados como duplicatas e eliminados erroneamente (dados não apresentados).Entretanto, para confirmar que a diversidade genética do banco não foi alterada com a retiradados acessos redundantes (BGM 1158, BGM 0367, BGM 0070, BGM 1156, BGM 0210, BGM 0195,BGM 1136, BGM 1294, BGM 0822, BGM 0279, BGM 0286, BGM 0878, BGM 0962, BGM 1306),calculou-se a gene diversity (H) antes e depois da retirada dos mesmos.  Esta diversidade genética,gene diversity (H), é usada para se medir a diversidade genética em acessos, conjunto de acessos ouuma coleção de acessos.  Se p é a freqüência da banda, a diversidade para aquele marcador, H = 1-(p2+ (1-p)2) = 2p(1-p) (Nei, 1987).                Para um cálculo mais preciso, utilizou-se os dados dos 18 alelos dos SSRs.  A medida dadiversidade genética (H) calculada para os 61 acessos utilizando-se o software POWERMARKER(Liu e Muse, 2005)  foi de 0,5937 e após a retirada dos acessos redundantes (BGM 1158, BGM 0367,BGM 0070, BGM 1156, BGM 0210, BGM 0195, BGM 1136, BGM 1294, BGM 0822, BGM 0279,BGM 0286, BGM 0878, BGM 0962, BGM 1306) foi de 0,6069. O ideal é que pelo menos estamedida se mantenha e não diminua e neste caso, com a retirada dos acessos duplicados, ela se5manteve.  Portanto, podemos seguramente eliminar os acessos tidos como redundantes sem ocasionarperda da variabilidade genética dentro do banco de germoplasma de mandioca da Embrapa Mandiocae Fruticultura.                  Embora esta metodologia talvez não seja a mais elaborada para se eliminar acessosredundantes de bancos de germoplasma, é uma metodologia mais simples e que fornece uma medidamuito próxima da realidade.               A importância do uso de marcadores moleculares fica evidente, uma vez que foi detectadouma grande diferença entre os grupos separados anteriormente apenas com base nos descritoresmorfológicos e posteriormente com o uso de marcadores em nível de DNA e a análise conjunta. Apossibilidade de unir os dados morfológicos e moleculares fornece mais confiabilidade nas análises,mostrando que todo o conjunto de informação pode ser utilizado.CONCLUSÕES O uso de marcadores RAPD e SSR foi eficiente na identificação de acessos duplicadospertencentes ao banco de germoplasma BAG-Mandioca da Embrapa Mandioca e Fruticultura.AGRADECIMENTOSÀ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) pelo apoio financeiro doprojeto.REFERÊNCIASChiorato, AF.,  Carbonell, SAM.,  dias, ALASD.,  Moura, RR.,  Chiavegato, MB.,  Colombo, CA.2006.  Identificatiom of common bean (Phaseolus vulgaris) duplicates using agromorphologicaland molecular data.  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Assessment of bulkingstrategies for RAPD analyses of flax germplasm.  Genetic Resources and Crop Evolution 50:743-746.Gower, 1971 J.C. Gower. 1971. A general coefficient of similarity and some of its properties,Biometrics 27:  857–874. Hintum, TV.  2003.  Molecular characterization of a lettuce germplasm collection. Eucarpia LeafyVegetables 2003 (eds. van Hintum, Th. JL., Lebeda, A.,  Pink, D., Schut, JW.). 99-104pp. Jaccard, P. (1901). Étude comparative de la distribution florale dans une portion des Alpes et des Jura. Bull. Soc.Vaudoise Sci. Nat. 37: 547-579.6Liu, K.,  Muse, SV. 2005.  PowerMarker: Integrated analysis environment for genetic marker data.Bioinformatics 21 (9): 2128-2129.Nei, M.  1987.  Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New York.Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA) software version 4.0. 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