ALVES, L.

POZZA, J. dos S.

RECH, D. V.

SILVA, V. S.

VAZ, C. S. L.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Detecção por PCR de Campylobacter termófilos em materiais de frangos de corte obtidos em frigorífico.

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Anais do Prêmio Lamas - 2011SanidadeDETECÇÃO POR PCR DE Campylobacter TERMÓFILOS  EM MATERIAIS DE FRANGOS DE CORTE OBTIDOS EM FRIGORÍFICO L Alves1,2, D Voss-Rech4, J Pozza1,3, VS Silva4, CSL Vaz4* 1Universidade do Contestado – UnC. Campus Concórdia.2Bolsista ITI/CNPq. 3Bolsista PIBIC/CNPq. 4Embrapa Suínos e Aves. Concórdia, SC, Brasil.IntroduçãoCampylobacter é uma das principais bactérias causadoras de gastrenterite em humanos. Estão presentes natural-mente no trato gastrointestinal de aves e outros animais de produção e cavidade oral de humanos. Dentre as espécies mais conhecidas estão os termófilos: C. coli, C. jejuni e C. lari, que vêm recebendo atenção devido à sua importância na segurança dos alimentos (1). Existem trabalhos sobre sua prevalência em granjas e abatedouros de frangos de corte baseados no diagnóstico bacteriológico (2). O objeti-vo deste estudo foi verificar a ocorrência de Campylobacter termófilos na linha de abate de um frigorífico através da reação em cadeia da polimerase (PCR) como método alternativo ao isolamento microbiológico.Material e MétodosForam coletados 32 suabes de cloaca durante a pendura das aves, 33 cecos e 31 carcaças após o gotejamento, oriundos de um lote de frangos de corte abatido sob Inspeção Federal no mesmo turno em um frigorífico da região Sul do Brasil. O material foi enriquecido em Caldo Bolton (CB) na proporção de 1:10, sob microaerofilia, a 41,5ºC por 48h (3) quando foram coletadas alíquotas para a extração de DNA pelos métodos de sílica diatomácea (1) e tiocianato de guanidina (4). A concentração e pureza dos DNAs obtidos foi determinada pela leitura da densidade óptica, em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 260nm e razão 260/280nm, respectivamente. A sensibilidade da PCR foi determinada a partir de um cultivo padrão de C. jejuni em CB, quantificado pelo método de diluição seriada na base 10 e plaqueado em Ágar Campy-Line em duplicata. Alíquotas de cada diluição foram submetidas a extração de DNA pelos dois métodos avaliados e posterior PCR. A determinação da especificidade da PCR foi realizada a partir da extração de DNA e PCR de cultivos ATCC das espécies de interesse e outras relacionadas (C. jejuni subsp. jejuni, C. jejuni subsp. doylei, C. coli, C. lari, C. upsaliensis, C. fetus venerealis, Arcobacter butzleri, A. skirrowii e S. Enteritidis). A inibição da PCR por material fecal presente nas amostras foi testada a partir de 1g de fezes de galinhas livres de Campylobacter, diluídas em PBS pH 7,4 nas proporções de 1:4 e 1:40. De cada diluição, 1mL foi transferido para 9mL de CB contaminado com uma alçada de C. jejuni subsp. jejuni (ATCC 33560) e incubadas sob microaerofilia a 41,5ºC/48h quando o DNA foi extraído por ambos os métodos. A PCR foi utilizada para amplificar uma região do gene RNAr 16S com um tamanho de 287 pb presente em C. coli, C. jejuni e C. lari, conforme previamente descrito (5). Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose 1,5% corado por brometo de etídio (0,5 µg/mL). O resultado da PCR foi confirmado pelo sequenciamento de DNA no ABI 3130 Genetic Analyzer a partir da purificação do produto amplificado utilizando o kit GFX PCR Purification e marcado com BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Os dados foram coletados com o software Data Collection v1.0.1 e as sequências de nucleotídeos obtidas foram comparadas com o GenBank utilizando o Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).Resultados e DiscussãoA concentração e a pureza do DNA obtido pelos métodos de extração avaliados foram equivalentes, porém, o limite de detecção a partir do protocolo de sílica foi menor (71 UFC/mL) que o obtido pelo de guanidina (7100 UFC/mL), sendo o DNA obtido pelo método de sílica utilizado para a PCR. A PCR utilizada amplificou as três espécies de inte-resse (C. coli, C. jejuni e C. lari) e também outras espécies de Campylobacter (C. upsaliensis e C. fetus venerealis) e outros gêneros de bactérias (A. skirrowii e A. butzleri), o que pode ter ocorrido pela proximidade da sequência de nucleotídeos. Porém, essas espécies não são tipicamente isoladas de aves, o que não invalida a PCR. O resultado da PCR não foi influenciado pela presença de material fecal no momento da extração de DNA, demonstrando não haver inibição do ensaio por fezes de aves. A PCR amplificou cerca de 95,8% das amostras coletadas no frigorífico (Tabela 1).Tabela 1 – Resultado obtido pela PCR Material (nº de amostras) Positivos NegativosSuabe de Cloaca (32) 29 3Conteúdo Cecal (33) 32 1Carcaça (31) 31 0Através do sequenciamento de DNA foi possível obter sequências de 222pb com 99% de similaridade com Campylobacter jejuni, coli e lari.ConclusãoFoi identificada a presença de DNA de Campylobacter termófilos através da PCR em 95,8% das amostras ana-lisadas. O método de extração de DNA por sílica foi o mais eficiente. A PCR utilizada pode ser aplicável para a detecção de Campylobacter termófilos em aves.Bibliografia1. Lawson AJ, Linton D, Stanley RJ. Journal of Applied Microbiology 1997; 83:375-380.2. Chaves SOC. 2007. f. 80. Dissertação - Curso de Mestrado em Ciência Animal. UFPA, Belém-PA.3. International Organization for Standardization. 10272- 1. 20064. Pitcher DG, Saunders NA, Owen RJ. Letters Applied Microbiology 1989; 8:151-15.5. Josefsen MH et al. Journal of Microbiological Methods 2004; 58:39-48. 

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