El consumo de vegetales contaminados con materia fecal es un problema de salud en todo el mundo. Los métodos actuales utilizados para investigar la posible presencia de patógenos, como Salmonella spp. y E. coli O157: H7 en estos alimentos, se basan en la búsqueda de organismos indicadores de contaminación fecal (FIBs); sin embargo, éstos métodos son tardados y no indican el origen de la contaminación. Se ha reportado que los microorganismos pertenecientes al orden Bacteroidales se pueden utilizar como indicadores alternativos para la identificación y cuantificación de la fuente de contaminación, ya que algunas especies son específicas de huésped debido a secuencias conservadas del gen ARNr 16S en su genoma. El objetivo de este trabajo fue identificar la fuente de contaminación fecal mediante el uso de marcadores genéticos de Bacteroidales específicos de huésped y determinar la asociación entre estos y los FIBs en lavados de fresas y tomates contaminados artificialmente con heces humanas y animales. La validación de los marcadores del gen ARNr 16S de Bacteroidales específicos de humano, bovino y canino, se realizó mediante PCR. Las muestras de tomate y fresa se contaminaron con heces diluidas con una carga inicial de Bacteroidales entre 6 y 7 log UFC/100 µl y de 3 a 6 log UFC/100µl de los FIBs coliformes totales, E. coli y Enterococcus spp. Los FIBs fueron enumerados por cuenta en placa y el marcador universal AllBac se cuantificó por qPCR, mientras que la fuente de contaminación se identificó por PCR punto final. El límite de detección de la qPCR fue de 1.35 a 10.35 copias de genes logarítmicas, correspondiente a un límite de cuantificación de 2 células. No se observó ninguna correlación entre los niveles de Bacteroidales y los FIBs en muestras de lavados de tomate y fresa contaminados con heces de humanos y bovinos. En las muestras de vegetales contaminadas, generalmente los niveles de Bacteroidales fueron mayores que los indicadores tradicionales; sin embargo, los indicadores tradicionales mostraron una alta variación en aquellas muestras contaminadas con bajas concentraciones de heces (0.1 y 0.01 mg). La detección de marcadores específicos de huésped en las muestras de lavado fue del 100% en casi todos los casos cuando las muestras estaban contaminadas con concentración de 10 y 1 mg de heces por fruto. Con base en estos resultados, el uso de Bacteroidales proporciona información para identificar la fuente de contaminación fecal, y podría ayudar a reducir los riesgos de contaminación de los productos frescos.
ABSTRACT
Fecal contamination associated with the consumption of vegetables is a health issue worldwide. Current methods used to investigate the possible presence of pathogens, such as Salmonella spp. and E. coli O157:H7 in vegetables, are based in searching fecal indicator organisms; however, these are time-consuming and do not indicate the origin of contamination. The order Bacteroidales can be used as an alternative indicator and for tracking the source of contamination, due to host-specific sequences conserved in its genome. The objective of this study was to identify the source of fecal contamination by using genetic markers specific for host Bacteroidales and determine the association between fecal contamination indicators, Bacteroidales and traditional bacteria, in strawberry and tomato rinsates. Fecal sources from humans and animals were used and added to tomato and strawberry samples. Validation of oligonucleotides of host-specific (human, bovine and canine) markers of the 16S rRNA gene of Bacteroidales was performed using PCR. Tomato and strawberry samples were contaminated with diluted stool with an initial charge of Bacteroidales (between 6 and 7 log CFU/100 µl) and 3 to 6 log CFU/100 µl of traditional indicators of the various hosts. Traditional indicators (E. coli, total coliform and Enterococcus) were enumerated and the universal marker AllBac was quantified by qPCR. Host source was identified by PCR. The limit of detection of PCR was 1.35 to 10.35 logarithmic gene copies, corresponding to an LOQ up to 2 cells. No correlation between levels of Bacteroidales and traditional bacterial indicators was observed in samples contaminated with human and bovine faces. In all samples of contaminated vegetables, levels of Bacteroidales was 2 log CFU higher than traditional indicators; however, traditional indicators showed high variation and E. coli from bovine source was not detected in contaminated samples with lower concentrations (0.1 y 0.01 mg). Identification of host specific markers in vegetables samples was 100% in almost all cases when the samples were contaminated with 10 and 1 mg of feces. Contamination with dog feces was detected by PCR in 100% in tomatoes even with 0.1 mg of feces, and in 60% in strawberry. Based on these results, the use of Bacteroidales provides information to identify the source of fecal contamination, and could help to reduce the risks of contamination of produce
