OKINO, C. H.

TREVISOL, I. M.

Portuguese

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AVESUI 2015  1  Falhas vacinais relacionadas à Bronquite Infecciosa das Galinhas 1 Cintia Hiromi Okino, DVM, MSc., PhD 2 Analista da Embrapa Suínos e Aves 3  4 Iara Maria Trevisol, DVM, MSc. 5 Pesquisadora da Embrapa Suínos e Aves 6  7 A bronquite infecciosa (BI) é uma doença viral aguda e altamente 8 infectocontagiosa, que afeta primariamente o trato respiratório das galinhas, e 9 dependendo do tropismo da estirpe circulante, pode acometer o sistema 10 reprodutivo, ocasionando queda na produção e na qualidade de ovos, e/ou os 11 rins ocasionando doença renal grave. 12 Essa doença também é frequentemente apontada como fator 13 desencadeante de infecções bacterianas secundárias, como micoplasmoses e 14 colibaciloses (Matthijs et al., 2009; Dwars et al., 2009), responsáveis por um 15 grande número de condenações de carcaça durante o abate.  16 Uma análise econômica das perdas ocasionadas pela BI na Inglaterra, 17 estimou ser uma das  doenças respiratórias mais importantes em aves 18 comerciais, responsável por perdas de aproximadamente 23 milhões de libras 19 anualmente (Jones, 2010).  Embora, não existam dados publicados da 20 quantificação econômica das perdas no Brasil, a doença é considerada um dos 21 problemas mais relevantes na área de sanidade de aves. 22  Um programa de biosseguridade adequado juntamente com sistemas de 23 criação de idade única são essenciais para medidas de controle, mas a 24 vacinação é normalmente necessária para aumentar a resistência das aves 25 contra infecções pelo vírus da BI (VBI) (De Wit el al., 2011).  Apesar das 26 estratégias de vacinação de frangos no primeiro dia de idade e repetidas 27 vacinações no ciclo de vida das aves comerciais, o VBI tem causado 28 significativas perdas na produção, indicando falhas no processo de vacinação, 29 por manejo incorreto das vacinas, ou insuficiente proteção cruzada conferida 30 pelo sorotipo vacinal utilizado no Brasil contra novas variantes desse vírus.  31  As variantes do VBI podem ser definidas como mutantes de estirpes 32 parentais desse vírus que diferem das estirpes clássicas em termos de 33 genótipo, patotipo, antigenicidade e/ou imunogenicidade. Os mutantes do VBI 34 estão constantemente sujeitos à eliminação pela resposta imune do 35 hospedeiro. Somente as estirpes com elevada variação antigênica são capazes 36 de escapar da proteção conferida pelo sistema imune induzida pelas vacinas e 37 sobreviver na população de hospedeiros, levando ao desenvolvimento de 38 doença clínica (Montassier, 2010).  39 AVESUI 2015  2  A classificação de estirpes do VBI pode ser feita por testes que analisam 40 e classificam diferenças encontradas no genoma do vírus (genótipos) ou por 41 testes que avaliam a atividade biológica do vírus (protectotipos, sorotipos e 42 patotipos) (De Wit et al., 2011). 43 a. Genótipos:  é baseada em variações na sequência de nucleotídeos do 44 genoma completo ou parcial (especialmente no gene S1) do vírus. De acordo 45 com o grau de homologia entre as sequencias gênicas, é possível “prever” o 46 grau de proteção cruzada entre a estirpe vacinal e o novo isolado de VBI, 47 embora isso não necessariamente implique em modificações do sorotipo ou 48 protectotipo. 49 b. Sorotipos: é baseada na reatividade cruzada entre o vírus (o qual 50 queremos classificar) e anticorpos anti-VBI soro-específicos usando a técnica 51 de vírus-neutralização. Duas estirpes (A e B) são consideradas do mesmo 52 sorotipo quando os títulos necessários para neutralização entre heterólogos 53 (anti-soro A com vírus B, e anti-soro B com vírus A) diferem pelo menos 20 54 vezes dos títulos necessários para homólogos (anti-soro A com vírus A, e anti-55 soro B com vírus B), em ambas direções. 56 c. Patotipos: é baseada na patogenicidade do vírus, ou seja, nos 57 órgãos/sistemas mais lesados pelo vírus, dependendo da estirpe viral. Embora 58 o VBI se replique em diferentes epitélios celulares, pode ou não causar lesão 59 no órgão. De acordo com essa classificação, as diferentes estirpes do VBI são 60 denominadas de acordo com o sistema/órgão acometido em: estirpes 61 respiratória, renal e reprodutiva. Embora, uma estirpe possa afetar mais de um 62 sistema.  63 d. Protectotipos: é baseado na evidenciação da proteção das aves 64 conferida por imunização prévia. É realizada através de experimentos “in vivo”. 65 Resumidamente, as galinhas SPF (“Specific Pathogen Free” – Livres de 66 patógenos específicos) são inoculadas/vacinadas com a estirpe A (que 67 geralmente é a estirpe encontrada na vacina “viva” comercialmente disponível); 68 após 3-4 semanas é realizada a segunda inoculação/desafio, com a estirpe B. 69 Após 5 dias as aves são sacrificadas e as traqueias são colhidas e avaliadas 70 pelo teste de ciliostase, onde é verificado o grau de estase ciliar. Se os cílios 71 apresentarem atividade ciliar normal, as aves são consideradas protegidas 72 devido à exposição prévia com a estirpe A. Nesse caso, as estirpes A e B 73 pertencem ao mesmo protectotipo. Outro método padrão utilizado é o 74 isolamento viral em ovos embrionados, onde, dependendo do percentual de 75 aves em que é feita a recuperação do vírus (isolamento viral) a partir das 76 traqueias, as aves são consideradas desprotegidas, e não pertencem ao 77 mesmo protectotipo.  78 Atualmente, a classificação de estirpes do VBI em genótipos é a mais 79 frequentemente utilizada em todo o mundo, inclusive no Brasil (Montassier et 80 AVESUI 2015  3  al., 2006, 2008; Villarreal et al., 2007a, 2007b, 2010; Fraga et al., 2013), devido 81 à maior praticidade e rapidez, e vem substituindo os testes de sorotipagem e 82 protectotipagem. Mas até que ponto essa classificação traz informações para o 83 campo? A genotipagem é importante em estudos epidemiológicos, e pode ser 84 considerada um “indicativo” de ausência de proteção cruzada entre a estirpe 85 vacinal e a estirpe circulante no campo, pois pequenas alterações de 86 aminoácidos na proteína S1 podem resultar em alteração de sorotipos devido à 87 alteração de epítopos vírus-neutralizantes. Na prática, os resultados de 88 genotipagem não fornecem resposta definitiva sobre a eficácia da proteção 89 vacinal frente ao desafio no campo com estirpes circulantes. Em contrapartida, 90 os testes de protectotipagem podem responder de forma eficiente se há ou não 91 proteção conferida pela vacinação frente ao desafio. 92 Em relação à formulação de vacinas atenuadas contra BI, principal tipo 93 de vacina indutora de proteção frente ao desafio, sabe-se que alguns países 94 permitem somente a utilização do sorotipo Massachusetts (Mass), como a 95 estirpe H120, como é o caso do Brasil. Em contrapartida, outros países 96 também permitem o uso de outras estirpes, como por exemplo, nos Estados 97 Unidos, onde são licenciadas as estirpes Connecticut, Arkansas (Ark), 98 Delaware 072 e Georgia 98 além da Mass, ou ainda no Reino Unido onde a 99 estirpe 4/91 também é licenciada (OIE, 2013, De Wit el., 2011). 100 O uso de múltiplos sorotipos em programas de vacinação contra BI é 101 justificado pelo aumento do espectro de proteção em resposta ao desafio, 102 frente à comprovada ausência de proteção cruzada entre determinadas 103 estirpes, demonstrada há muito tempo (Hofstad, 1961, 1981, Gelb et al., 1981). 104 No Brasil, alguns trabalhos têm avaliado a proteção conferida pelas 105 vacinas atenuadas comercialmente disponíveis (Mass), frente aos isolados de 106 campo brasileiros considerados variantes do VBI. O primeiro trabalho que 107 caracterizou protectotipos brasileiros (Di Fábio et al., 2000), demonstrou que 108 embora tenham sido encontrados sorotipos diferentes do  Mass (4 isolados 109 avaliados), a vacina (H120) apresentou proteção completa contra 3 isolados e 110 proteção parcial contra 1 isolado.  111 Em 2006, um estudo que identificou um isolado de campo brasileiro foi 112 caracterizado como de patogenicidade principal para gônadas, e após o teste 113 de protectotipagem, foi verificado que a vacina atenuada H120 conferia 114 proteção contra o desafio por esse vírus (Pereira et al., 2006). 115 Outro isolado de campo brasileiro, genotipado como variante do VBI, foi 116 caracterizado como nefropatogênico, e após avaliação da proteção cruzada 117 conferida pela vacina H120, foi verificada proteção parcial (Fernando et al., 118 2013). 119 AVESUI 2015  4  Ainda em relação aos testes de protectotipagem (utilizando-se a vacina 120 atenuada do sorotipo Mass do VBI), cinco isolados de campo brasileiros, 121 também genotipados como variantes do VBI, de patogenicidade 122 predominantemente respiratória, apresentaram proteção cruzada satisfatória 123 com estirpe vacinal (Trevisol 2010, 2012, 2014, 2014b).  124 Finalmente, mais quatro isolados de campo brasileiros, os quais a 125 homologia entre aminoácidos com M41 quanto ao gene S1 do VBI foi inferior a 126 72,8%, apresentaram bons níveis de proteção cruzada frente à imunização 127 com vacinas do sorotipo Mass (De Wit el., 2014). 128 Em resumo, de acordo a metodologia preconizada pela Organização 129 Mundial de Saúde Animal (OIE) (OIE, 2013) para teste de eficácia vacinal 130 contra BI, que prevê o uso do reisolamento viral ou da avaliação de ciliostase 131 em amostras traqueais, de todos os resultados de estudos de protectotipagem 132 de isolados de campo brasileiros, 13 isolados (de um total de 15 isolados 133 avaliados) apresentaram proteção-cruzada adequada conferida pela vacina 134 Mass frente ao desafio, enquanto dois isolados apresentaram proteção parcial.  135 Nesse contexto, cabe-se questionar se os problemas relacionados às 136 falhas vacinais frente ao desafio pelo VBI observados no campo, no Brasil, são 137 de fato restritos a alterações antigênicas das estirpes circulantes que 138 impossibilitariam a proteção cruzada conferida pelo único sorotipo (Mass) 139 permitido na formulação de vacinas comerciais no país. 140 A administração da vacina atenuada contra a BI pode ser realizada de 141 três formas principais (Tabela 1), sendo que para todas elas é importante 142 considerar que a estabilidade da vacina diluída é mantida pelo curto período de 143 uma hora (Okino et al., 2015). 144 Tabela 1. Vias de administração da vacina atenuada contra BI, e principais 145 recomendações. 146 Via de administração da vacina Principais recomendações Água de beber - Utilizar água sem cloro - Ajustar pH 6,0 – 7,5 - Jejum hídrico de 60-120 minutos Óculo-nasal - Esperar completa absorção da gota antes de soltar a ave - Evitar aquecer frasco da vacina (mãos) “Spray” incubatório - Ideal utilizar água fria - Ajustar gotas para 100-300 micras “Spray” no campo - Direcionar jato de “spray” para cabeça das aves  147 Nos Estados Unidos, os relatos de falhas de proteção referentes à 148 vacinação com sorotipo Ark DPI frente ao desafio por estirpes “Ark like”, 149 AVESUI 2015  5  inicialmente apontados serem devido ao aparecimento de “quasispecies” 150 dentro desse sorotipo, e consequente proteção cruzada insuficiente, foram 151 melhor avaliados, e foi demonstrado serem devido a falhas na aplicação da 152 vacina e não por alterações antigênicas (De Wit et al., 2011). 153 Ainda em relação à vacinação com sorotipo Ark da BI, um recente 154 estudo demonstrou que a via de administração e dose vacinal envolvidos 155 podem influenciar na eficácia da vacinação. Nesse estudo, foi demonstrado 156 que a vacinação via “spray” utilizada no incubatório não foi eficaz em conferir 157 proteção, por outro lado quando administrada via ocular a proteção foi obtida 158 de forma satisfatória. Além disso, duas doses da vacina administradas em 7 mL 159 a 20 aves apresentaram melhores índices de proteção quando comparado à 160 utilização de duas doses em 7mL  a um grupo de 40 aves. Sugerindo que 161 combinação de via de administração, dose e volume de vacina são fatores 162 importantes na indução de proteção (Roh et al., 2013).  163 Em outro estudo, foi observado que a dose de vacina atenuada contra o 164 VBI administrada no primeiro dia de idade via óculo-nasal possui influência na 165 indução de respostas imunes locais e por consequência, no desencadeamento 166 de lesões ocasionadas pelo vírus de desafio. Ou seja, quanto maior a dose de 167 vacina administrada, melhores foram as respostas imunes humoral e celular 168 locais, melhor uniformidade do grupo, e menores os escores de lesões 169 microscópicas foram observadas na traqueia, após desafio com vírus 170 patogênico (Okino et al., 2013). 171 Dado todo o exposto, em casos de presença de desafio de BI no campo, 172 é importante considerar uma série de fatores antes de apontar as alterações 173 antigênicas como causa única de falhas vacinais, como por exemplo: via de 174 administração, dose, título, data de expiração, armazenamento, uniformidade 175 da vacinação no lote e boas práticas de manejo.  176  177 Referências:  178 De Wit, J.J.; Brandão, P.; Koopman, R.; Villarreal, L.Y.B. Report of genotyping, 179 pathotyping and protectotyping of IBV strains from Brazil. In: 8th International 180 Symposium on Avian Corona- and Pneumoviruses and complicating pathogens, 181 2014, Rauischholzhausen. Proceedings… Giessen, 2014. 182 De wit, J.J.; Cook, J.K.A.; Heijden, H.M.J.F. Infectious bronchitis virus variants: 183 a review of the history current situation and control measures. Avian Pathol., 184 v.40 (3), p. 223-235, 2011. 185 Di Fabio, J.; Rossini, L.J.; Orbell, S.J.; Paul, G.; Huggins, M.B.; Malo; A.; Silva, 186 B.G.; Cook, J. K. Characterization of infectious bronchitis viruses isolated from 187 AVESUI 2015  6  outbreaks of disease in commercial flocks in Brazil. Avian Dis., v. 44(3), p. 582-188 589, 2000. 189 Dwars, R.M.; Matthijs, M.G.R.; Daemen, A.J.J.M.; van Eck, J.H.H.; Velverde, L.; 190 Landman, W.J.M. Progression of lesions in the respiratory tract of broilers after 191 single infection with Escherichia coli compared to superinfection with E.coli after 192 infection with infectious bronchitis virus. Vet. Immunol. Immunopathol., v.127, 193 p.65-76, 2009. 194 Fernando, F.S.; Montassier, M.F.S.; Silva, K.R.; Okino,C.H.; Oliveira, E.S.; 195 Fernandes, C.C.; Bandarra, M.B.; Gonçalves, M.C.M.; Borzi, M.M.; Santos, 196 R.M.; Vasconcelos, R.O.; Alessi, A.C.; Montassier, H.J. Nephritis associated 197 with S1 variant brazilian isolate of infectious bronchitis virus and vaccine 198 protection test in experimentally infected chickens. Int. J. Poul. Sci., v.12(11), 199 p.639-646, 2013. 200 Fraga, A.P.; Balestrin, E.; Ikuta, N.; Fonseca, A.S.; Spilki, F.R.; Canal, C.W.; 201 Lungee, V.R. Emergence of a new genotype of Avian Infectious Bronchitis virus 202 in Brazil. Avian Dis., v.57, p.225-232, 2013.  203 Gelb, J.; Perkins, B.E.; Rosenberger, J.K.; Allen, P.H. Serologic and cross-204 protection studies with several infectious bronchitis virus isolates from 205 Delmarva-reared broiler chickens. Avian Dis., v.25, p. 655-666, 1981.  206 Hofstad, M.S. 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Falhas vacinais relacionadas à bronquite infecciosa das galinhas.

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