D´VILA, A.

ESTEVES, P. A.

OSOWSKI, G. V.

Portuguese

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  94  UTILIZAÇÃO DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) E RESTRIÇÃO ENZIMÁTICA PARA DETECÇÃO DO GIROVÍRUS AVIÁRIO TIPO 2 (AGV2)   Germana V. Osowski¹; Paulo A. Esteves² e Alessandra D’Avila3 ¹Graduanda em Ciências Biológicas pela Universidade do Oeste de Santa Catarina, Campus Joaçaba, estagiária da Embrapa Suínos e Aves e bolsista CNPQ/PIBIC, germanavizzottoosowski@hotmail.com ²Pesquisador da Embrapa Suínos e Aves 3Pós doutorado Empresarial - CNPq  Palavras chave: clonagem, reação em cadeia da polimerase, restrição enzimática, enzima de restrição, plasmídeo, Escherichia coli.  INTRODUÇÃO O girovirus aviário tipo 2 (AGV2) é um vírus recentemente detectado e que, devido a características genômicas, foi sugerido pertencer, à família Circoviridae, gênero Gyrovirus. O AGV2 encontra-se amplamente distribuído sem ter sido, até o presente momento, associado diretamente com alguma patologia conhecida (1). Contudo, para que seja possível avaliar o real impacto da presença do AGV2 na saúde das aves, é necessária a realização de estudos bem como a padronização de técnicas que possam ser utilizadas para uma melhor compreensão da biologia deste vírus. Dessa forma, o presente trabalho objetivou a utilização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) e enzimas de restrição para obtenção da clivagem de DNA plasmidial contendo um fragmento genômico de AGV2 previamente inserido através da técnica de clonagem de DNA. A clonagem é um processo pelo qual fragmentos genômicos de interesse (insertos) são ligados a moléculas circulares de DNA dupla fita (plasmídeos). Após tal ligação a molécula recombinante (plasmídeo + inserto) é inserida em um hospedeiro viável (neste caso a bactéria Escherichia coli) em um procedimento denominado transformação, que pode dar-se através de meios físicos (choque térmico) ou elétricos (eletroporação). Após a realização satisfatória da transformação, o plasmídeo recombinante poderá, por exemplo, caso seja um plasmídeo construído para tal finalidade, multiplicar-se (DNA plasmidial + inserto) inúmeras vezes de forma independente do cromossoma bacteriano. Após, o DNA recombinante pode ser obtido através da extração do DNA plasmidial seguida da identificação da presença do inserto, através de procedimentos tais como: PCR ou Clivagem com Enzimas de Restrição. A PCR realiza detecção da presença da região-alvo através da amplificação de tal DNA, utilizando-se primers e uma polimerase recombinante (Taq DNA polimerase) que sintetiza cópias do DNA alvo. Inicialmente ocorre um processo de desnaturação (separação) das moléculas de cadeia dupla do DNA, seguido do pareamento e anelamento dos primers com as regiões específicas do DNA alvo e, finalmente, a etapa de síntese de DNA onde ocorre a cópia do DNA em questão (2). Ao final destas três etapas, repetidas cerca de 30-40 vezes em um equipamento que controla o tempo e a variação da temperatura (termociclador), ocorre um aumento exponencial do número de cópias correspondente a sequência alvo. Já a clivagem com enzima de restrição irá separar o inserto (DNA alvo) do DNA plasmidial. Isso ocorre como resultado do reconhecimento seguido do corte de uma determinada região por parte da enzima de restrição.  MATERIAL E MÉTODOS Foram selecionadas amostras de DNA plasmidial recombinantes previamente testadas para presença do fragmento genômico do AGV2. A transformação bacteriana (clonagem) foi realizada utilizando-se células competentes (InvitrogenTM) de E. coli e o DNA de interesse (inserto). Após incubação em banho de gelo, foi provocado um choque térmico (42ºC), para que o DNA recombinante (plasmídeo + inserto) fosse inserido nas células competentes. Em seguida, as células foram semeadas em meio de cultura sem antibiótico sob agitação (37ºC), para que houvesse replicação das E. coli. Posteriormente as bactérias foram plaqueadas em meio de cultura sólido na presença de antibiótico, e mantidas em estufa (37ºC) para promoção de crescimento de algumas colônias isoladas, ou seja, os clones. Após, oito clones foram selecionados e incubados em 2 ml de meio de cultura Luria Bertani (LB) constituído de extrato de levedura e mantidas sob agitação (37ºC/200 rpm) por cerca de 18 horas. Subsequentemente, após a comprovação visual de crescimento bacteriano em cada tubo, as amostras foram submetidas a extração do DNA plasmidial utilizando-se o kit comercial QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN®), segundo as instruções do fabricante. Após a extração do DNA recombinante foi realizada a detecção da presença do inserto viral no DNA plasmidial através da execução das técnicas de PCR e restrição enzimática, conforme descritas a seguir. A PCR foi realizada sob as seguintes condições: 99°C/ 1 minuto (desnaturação inicial); 94°C/1 minuto (desnaturação); 62°C/ 1 minuto (anelamento); 72°C/ 1 minuto (extensão ou síntese), seguida de uma extensão final (72°C/ 1 minuto), sendo que as etapas de desnaturação inicial e extensão final ocorrem uma única vez, enquanto que as demais etapas (desnaturação, anelamento e síntese) ocorreram 35 vezes. A seguir, foi realizada a clivagem enzimática objetivando a separação dos fragmentos de DNA (inserto + plasmídeo), utilizando-se da enzima de restrição BIOTEC EcoR I (Ludwig ®) (1µl), tampão de enzima (1µl), água MiliQ (5µl) e o DNA alvo (100ng/3µl). Após um período de incubação de 1h (37ºC) as amostras de ambas as técnicas foram submetidas à eletroforese em gel de agarose, que possibilita a distribuição dos fragmentos genômicos em ordem decrescente de tamanho. O material foi, então, corado   95  com Brometo de Etídio e os resultados destes procedimentos foram visualizados sob luz ultra violeta (UV).  RESULTADO E DISCUSSÕES No presente estudo foi utilizada a técnica de PCR com a Taq DNA polimerase (Figura 1), uma enzima termoestável que tem a capacidade de polimerização de ácidos nucléicos, sintetizando o DNA de acordo com á região especifica ligada pelos primers (sentido 5’-3’) (3), e a clivagem com a enzima EcoR I  (Figura 2) que identifica e corta a seguinte região do DNA: 5’ AATT 3’ (3’ TTAA 5’ na fita complementar) (3). A partir destas duas técnicas foi possível verificar a presença do DNA do AGV2 e o DNA plasmidial da E. coli, sendo o DNA do plasmídeo visivelmente apresentando maior peso molecular, comparado com o inserto (AGV2).  CONCLUSÕES Conforme descrito no presente trabalho, os resultados alcançados foram satisfatórios no que diz respeito à clonagem e detecção de AGV2 através das técnicas de PCR e clivagem. Estas ferramentas de diagnóstico podem então ser utilizadas para verificação da dispersão do vírus AGV2 e dessa forma, entender melhor a ecologia destes agentes.  REFERÊNCIAS 1. BRENTANO, L.; MORES, N.; WENTZ, I.; CHANDRATILLEKE, D.; SCHAT, K. A. Isolation and identification of chicken infectious anemia vírus. In: Brazil. Avian Diseases, 1991. 793-800 p. 2. FLORES, E. F.; SCHERER, C. Diagnóstico Virológico. In: Virologia Veterinária, 1. ed. Santa Maria: Editora UFSM, 2008. 43 p. 3. NEW ENGLAND BIOLABS, 2000.01 Catalog & Technical Reference, 2000. 140 p.    Figura 1. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio visualizado à luz ultravioleta. Canaletas 1 e 12: padrão de peso molecular 100pb (Invitrogen ®). Canaletas 2 a 9: amostra de AGV2 (aprox. 360pb). Canaleta 10: controle positivo de AGV2 (aprox. 360pb). Canaleta 11: controle negativo.    Figura 2. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio visualizado á luz ultravioleta. Canaletas 1 e 15: padrão de peso molecular 1Kb (Invitrogen ®). Canaletas 2 a 9: amostras clivadas (inserto com aprox. 360pb). Canaleta 10: controle positivo clivado (inserto com aprox.. 360pb). Canaleta 11: controle negativo. Canaleta 12 plasmídeo não clivado. Canaleta 13: PCR do material clonado de AGV2 (aprox. 360pb) Canaleta 14: controle negativo da PCR. * (Plasmídeo linearizado aprox. 2.500pb); # (Plasmídeo relaxado aprox. 4.500pb); € (Plasmídeo enrolado aprox. 6.000pb).   1      2      3      4      5      6      7       8     9      10    11     12    13    14    15 1      2     3     4      5     6     7     8     9    10    11   12   * # # €  

Utilização da reação em cadeia da polimerase (PCR) e restrição enzimática para detecção do girovírus aviário tipo 2 (AGV2).

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/1032112/1/final8060.pdf

Utilização da reação em cadeia da polimerase (PCR) e restrição enzimática para detecção do girovírus aviário tipo 2 (AGV2).

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