FINATTO, T.

GIRARDI, C. L.

LAURENS, F.

QUECINI, V.

ROMBALDI, C. V.

STORCH, T. T.

Portuguese

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

 1Quím. de Alim., estudante de pós-graduação, Universidade Federal de Pelotas-RS, e-mail: tatistorch86@hotmail.com 2Bióloga, bolsista CAPES/PNPD, Embrapa Uva e Vinho-RS, e-mail: tfinatto@gmail.com 3Eng. Agr., pesquisador Embrapa Uva e Vinho-RS, e-mail: girardi@cnpuv.embrapa.br 4Professor, Universidade Federal de Pelotas – Dept. Ciência e Tecnologia Agroindustrial –s/n caixa postal 354, 96010-900, Pelotas, RS – Brasil, e-mail: cesarvrf@ufpel.tche.br 5Pesquisador UMR 1259 Génétique et Horticulture (GenHort) Angers, France, e-mail : francois.laurens@angers.inra.fr ASSOCIAÇÃO ENTRE A INDUÇÃO TRANSCRICIONAL DE UMA α-L-ARABINOFURANOSIDASE E ETILENO EM POLPA DE MAÇÃ ‘GALA’ ARMAZENADA SOB REFRIGERAÇÃO  TATIANE TIMM STORCH1; TACIANE FINATTO2; VERA QUECINI3; CÉSAR VALMOR ROMBALDI4; FRANÇOIS LAURENS5; CÉSAR LUIS GIRARDI3  INTRODUÇÃO Alterações na textura de frutos, tais como a farinosidade de polpa em maçãs da variedade ‘Gala’ têm sido relacionadas à ação de enzimas que modificam a parede celular (GOULÃO et al., 2007; NOBILE et al., 2011) sendo que algumas destas têm sua transcrição e atividade influenciadas pelo etileno (BENNETT; LABAVITCH, 2008). Entre as enzimas que modificam a parede celular, destaca-se a α-L-arabinofuranosidase por apresentar atividade ressaltada em estádios avançados de amadurecimento (GOULÃO et al., 2007). Em maçã, análises filogenéticas da sequência codificadora dos genes de α-L-arabinofuranosidases têm demonstrado que estes são agrupados em duas famílias: a família das Glicosil Hidrolases 51 (GH51), onde está incluído o gene MdAF1 (GOULÃO et al., 2008), e Glicosil Hidrolases 3 (GH3), onde está agrupado o gene MdAF3, cuja transcrição foi demonstrada em associação ao aparecimento da farinosidade de polpa em genótipos de maçã suscetíveis ao distúrbio (NOBILE et al., 2011). Entretanto, estudos adicionais são necessários a fim de avaliar a dependência de MdAF3 ao etileno.  Assim, o presente trabalho apresenta resultados preliminares que sugerem a influência do etileno sobre a regulação transcricional dos genes MdAF1 e MdAF3 que codificam α-L-arabinofuranosidases das famílias GH51 e GH3, respectivamente. Para tal, foi avaliada a transcrição dos dois genes em frutos tratados com etileno exógeno e com o inibidor 1-MCP (1-metilciclopropeno), em comparação ao nível transcricional dos genes MdACO, que codifica a enzima ACC oxidase - ácido aminociclopropano carboxílico oxidase, envolvida na biossíntese de etileno - e MdERF1, que codifica um fator de transcrição da superfamília APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR,  e é relacionado à sinalização mediada pelo  etileno.  848  MATERIAL E MÉTODOS A análise transcricional foi realizada empregando maçãs (Malus domestica Borkh) do clone Baigent (cv. Gala), colhidas em pomares comerciais do município de Caxias do Sul, na safra 2009. Os frutos foram transportados até a sede da Embrapa Uva e Vinho, onde receberam tratamentos com 10 ppm de etileno ou 625 ppb de 1-MCP (Agro Fresh - 0,14%). Frutos da condição controle não foram tratados. Uma parcela dos frutos tratados e não tratados foi mantida em temperatura ambiente (± 25°C) durante 12 dias, enquanto a outra parcela foi armazenada sob refrigeração (AR)  por 6 meses a 0°C e ±95% de umidade relativa.  Neste trabalho, são relatados resultados preliminares, obtidos por RT-qPCR (transcrição reversa – reação em cadeia da polimerase em tempo real), referentes à transcrição dos genes MdAF3, MdAF1, MdACO e MdERF1 em  frutos mantidos por 9 dias à temperatura ambiente e por  2, 4 e 6 meses sob AR. Para a avaliação do acúmulo de transcritos, extraiu-se o RNA da polpa dos frutos segundo o método modificado de Zeng e Yang, 2002. Em seguida, o DNA genômico foi eliminado por tratamento com DNAse I (BioLabs) e a primeira fita de  cDNA foi sintetizada utilizando a enzima M-MLV-Reverse Transcriptase (Promega). Finalmente, a análise do acúmulo de transcritos foi feita por PCR em Tempo Real (qPCR) em equipamento StepOne (Applied Biosystems) utilizando-se do kit SYBR® Green PCR Master Mix (Life Technologies). A quantificação relativa dos transcritos foi efetuada pelo método 2-ΔΔCT, sendo o gene MdACT, que codifica uma β-actina, utilizado como controle endógeno e o cDNA referente à colheita utilizado como amostra referência. As análises foram conduzidas fazendo-se uso de replicatas técnicas.  RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da análise transcricional estão exibidos na Figura 1, onde o baixo nível de transcrição do gene MdACO demonstra que o tratamento com 1-MCP foi eficiente em reduzir a síntese autocatalítica de etileno, pois os níveis de transcrição  desse gene foram menores nos frutos tratados com o inibidor em todos os períodos avaliados. Esse resultado comprova a inibição da ação do etileno pelo 1-MCP na situação experimental utilizada. O composto 1-MCP é um inibidor competitivo do etileno, ocupando seus sítios receptores e impedindo sua ação (BLANKENSHIP; DOLE, 2003).  A transcrição do gene MdAF3 foi fortemente induzida pelo tratamento com etileno, e reduzida com o uso do 1-MCP. Exceto em 6 meses sob AR, MdAF3 apresentou um comportamento transcricional bastante semelhante à MdACO, como pode ser visualizado na Figura 1. Esses resultados demonstram que o gene é positivamente regulado pelo etileno. Essa regulação positiva pelo etileno e a presença de transcritos até 6 meses de armazenamento, com pico de transcrição aos 2 meses, sugerem o envolvimento da atividade transcricional de MdAF3 com a farinosidade de 849  polpa em maçã ‘Gala’, que é observada em frutos desta variedade após o terceiro mês de AR (BRACKMANN, 1992). De forma complementar, está sendo conduzido um trabalho adicional incluindo a análise do comportamento transcricional de MdAF3 e a atividade enzimática α -L-arabinofuranosidase, a fim de avaliar uma possível resposta bioquímica à transcrição do gene.  Figura 1 - Agrupamento hierárquico baseado no perfil transcricional de MdACO, MdERF1, MdAF3 e MdAF1 em resposta ao etileno e 1-MCP, em diferentes tempos de armazenamento (9 dias, 2, 4 e 6 meses). O perfil transcricional está representado por escala de cores (heatmap), conforme a legenda, onde a cor verde representa os mais baixos acúmulos de transcritos e a cor vermelha os mais altos. Os valores de acúmulo de transcritos estão expressos em log2.  A transcrição do gene MdAF1 foi extremamente baixa em frutos controle, o que indica que sua transcrição não tem influência sobre as mudanças na textura de frutos durante o amadurecimento e senescência em maçãs armazenadas sob AR. No presente trabalho, também foi observado que o tratamento com etileno propiciou um aumento considerável nos transcritos MdAF1 demonstrando que a expressão deste gene é regulada positivamente por etileno. Em relação aos demais genes avaliados, MdAF1 apresentou um comportamento transcricional único em todos os períodos, apresentando maior similaridade apenas com MdAF3 em 6 meses sob AR.  O gene MdERF1, que codifica uma proteína com um domínio de ligação ao DNA, funcionando como fator de transcrição envolvido em respostas ao etileno (WANG et al 2007), não se mostrou exclusivamente dependente do etileno, já que apresentou alta transcrição nos frutos tratados com 1-MCP, principalmente aos 9 dias em  temperatura ambiente e 2 meses sob AR. Esses resultados reforçam a hipótese de que o etileno não é o único regulador transcricional de MdERF1. 850  Porém, aos 4 meses sob AR, o perfil transcricional de MdERF1 foi semelhante ao de MdACO, indicando maior influência do etileno sobre a transcrição deste gene neste período quando o mesmo comportamento foi também observado em MdAF3. Ainda assim, não é possível afirmar que a transcrição de MdERF1 tem relação com o perfil transcricional dos genes codificadores de enzimas de parede celular estudados neste trabalho.  CONCLUSÃO A transcrição dos genes MdAF3 e MdAF1 mostra-se dependente da presença de etileno em todos os períodos avaliados, diferentemente de MdERF1 que apresenta alto acúmulo de transcritos em frutos tratados com 1-MCP. Houve alta similaridade entre o comportamento transcricional de MdAF3 e MdACO, o que ressalta a influência do etileno sobre o primeiro gene. Com base nestes resultados, pesquisas mais aprofundadas visando esclarecer a função de MdAF3 na farinosidade de polpa da cultivar “Gala” estão em andamento.   REFERÊNCIAS  BENNETT, A. B; LABAVITCH, J. M. Ethylene and ripening-regulated expression and function of fruit cell wall modifying proteins. Plant Science. v. 175, p. 130-136. 2008. BLANKENSHIP, S.M.; DOLE, J.M. 1-Methylcyclopropene: a review. Postharvest Biology and Technology. v.28, p.1-25. 2003. BRACKMANN, A. Produção de etileno, CO2 e aroma de cultivares de maçã. Revista Brasileira de Fruticultura, Cruz das Almas-BA, v.14, n.1, p.103-108, 1992. GOULAO, L.F; SANTOS, J; SOUSA, I; OLIVEIRA, C.M. Patterns of enzymatic activity of cell wall-modifying enzimes during growth and ripening of apples. Postharvest Biology and Technology. v. 43, p. 307-318. 2007. GOULAO, L.F; OLIVEIRA, C.M. Cell wall modifications during fruit ripening: when a fruit is not the fruit. Trends in Food Science & Technolology. v. 19, p. 4-25. 2008. NOBILE, P.M; WATTEBLED, F; QUECINI, V; GIRARDI, C.L; LORMEAU, M; LAURENS, F. Identification of a novel a-L-arabinofuranosidase gene associated with mealiness in apple. Journal of Experimental Botany, Lancaster-UK, 2011.  ZENG, Y; YANG, T. RNA Isolation from highly viscous samples rich in polyphenols and polysaccharides. Plant Molecular Biology Reporter. v. 20, p. 417a–417e. 2002. WANG, A., TAN, D., TAKAHASHI, A., LI, T.Z., HARADA, T., MdERFs, two ethylene response factors involved in apple fruit ripening Journal of Experimental Botany, Lancaster-UK, n,58, p3743–3748. 2007.  851

Associação entre a indução transcricional de uma α-l-arabinofuranosidase e etileno em polpa de maçã 'Gala' armazenada sob refrigeração.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/945018/1/Stork22CBF2012p848851.pdf

Associação entre a indução transcricional de uma a-l-arabinofuranosidase e etileno em polpa de maçã 'Gala' armazenada sob refrigeração.

Associação entre a indução transcricional de uma a-l-arabinofuranosidase e etileno em polpa de maçã 'Gala' armazenada sob refrigeração.

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