AZEVEDO, A. S. de

BARTHOLAZZI, A. J.

OLIVEIRA, C. S.

PACHECO, A.

QUIRINO, C. R.

SERAPIÃO, R. V.

VEGA, W. H. O.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Associação entre polimorfismo no gene BMP4 e características de OPU-PIVE em vacas Gir.

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 XXIV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA Universidade Federal do Espírito Santo Vitória ES, 12 a 14 de maio de 2014 A Zootecnia Fazendo o Brasil Crescer  www.zootec.org.br   1 Associação entre polimorfismo no gene BMP4 e características de OPU-PIVE em vacas Gir  Wilder Hernando Ortiz Vega1,Celia Raquel Quirino2, Amanda Silva de Azevedo3, Aline Pacheco4, Clara Slade Oliveira5,Raquel Varella Serapião6, Aylton Junior Bartholazzi7  1 Doutorando Ciência animal CAPES – UENF Rio de Janeiro, Brasil –Email: wilortvet@yahoo.es 2Professora do Laboratório de reprodução e melhoramento genético animal – UENF. Bolsista CNPq. Rio de Janeiro, Brasil 3 Bolsista de Universidade Aberta,  PROEX – UENF 4Bolsista Pós Doutorado CAPES/FAPERJ – UENF, Rio de Janeiro, Brasil 5Clara Slade Oliveira EMBRAPA Gado de Leite, CESM, Valencia RJ  6Raquel Varella Serapião, PESAGRO-RIO Valencia RJ 7Aylton Junior Bartholazzi. Bolsista de Mestrado CAPES – UENF   Resumo: A Proteína Morfogênica do Osso 4  (BMP4) é um membro do fator de crescimento transformante beta (TGFβ); superfamília que controla inúmeros eventos do desenvolvimento embrionário, fetal e até mesmo de adultos em todos os vertebrados. O objetivo deste estudo foi avaliar o grau de associação entre um polimorfismo no gene BMP4 e características relacionadas à produção de embriões in vitro, bem como a prenhez após transferência. O DNA foi extraído de folículos pilosos de 50 vacas Gir doadoras de oócitos, a genotipagem foi realizada por PCR-RFLP. Foram coletados dados de 212 sessões de OPU-PIVE. As características da OPU-PIVE associadas ao marcador SNP foram: número e proporção dos complexos cumulus-oócitos viáveis, número e proporção de embriões clivados no dia 4 de cultura, número e proporção de embriões transferíveis no dia 7 de cultura, número e proporção de prenhezes no dia 30 após a transferência e, número e proporção de prenhezes no dia 60 após a transferência. Foi feita análise de variância utilizando PROC GLIMMIX do SAS 9.2, para avaliar o efeito do polimorfismo sobre as características estudadas. O polimorfismo apresentou associação significativa (P<0,01) com número e proporção dos complexos cumulus-oócitos viáveis e proporção de prenhezes aos 30 dias. O genótipo mutante (GT) afetou negativamente características como número e proporção dos complexos cumulus-oócitos viáveis e proporção de prenhezes aos 30 dias.       Palavras–chave: OPU-PIVE, SNP , mutação sinónima   Associação entre polimorfismo no gene BMP4 e características de OPU-PIVE em vacas Gir   Abstract: Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) is a member of the transforming growth factor beta (TGFβ); superfamily that controls many events in embryonic , fetal and adult development even in all vertebrates . The aim of this study was to evaluate the degree of association between a polymorphism in BMP4 gene related to the of embryo in vitro production traits, and pregnancy after transfer. DNA was extracted from hair follicles 50 Gyr cows donor oocytes, genotyping was performed by PCR-RFLP . Database of 212 OPU- IVP sessions were collected . The characteristics of OPU- IVP associated marker SNP were : number and proportion of cumulus -oocyte complexes viable , number and proportion of cleaved embryos on day 4th of culture, the number and proportion of transferable embryos on day 7th of culture, the number and proportion of pregnancies on day 30 after transfer , and the number and proportion of pregnancies on day 60 after transfer. ANOVA using PROC GLIMMIX of SAS 9.2 to evaluate the effect of the polymorphism on the characteristics studied was made. The polymorphism was significantly associated (P < 0.01) with number and proportion of cumulus -oocyte complexes viable and proportion of pregnancies at 30 days. The mutant genotype (GT) adversely affects characteristics such as number and proportion of cumulus -oocyte complexes viable and proportion of pregnancies at 30 days.  Keywords: OPU-IVP, SNP, mutation synonymous    Introdução Variabilidade nos resultados em diferentes trabalhos referentes aos índices de produção oocitária, taxas de prenhez e tipo de raça, entre outras, são evidentes quando se comparam dados de Produção In vitro de Embriões (PIVE) de diferentes vacas doadoras de oócitos (Pontes, et al., 2009).   XXIV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA Universidade Federal do Espírito Santo Vitória ES, 12 a 14 de maio de 2014 A Zootecnia Fazendo o Brasil Crescer  www.zootec.org.br   2  La Rosa et al., (2011) concluíram que BMP4 está implicado na maturação de oócitos bovinos com efeitos sobre as taxas de clivagem e estado pluripotente da célula embrionária. Outo estudo relatou associação entre Polimorfismo de um Único Nucleotídeo (SNP) no gene BMP4 e taxa de blastocistos em vacas da raça Holandesa avaliadas por modelo in vitro (Li et al., 2012). As diferenças genéticas entre Bos taurus taurus e Bos taurus indicus foram confirmadas nos estudos de associação genômica para diferentes características de interesse econômico, quando SNPs associados com locus de características quantitativas (QTLs) no grupo taurino, não sendo significativos no grupo indicus. (Canavez, et al., 2012, Höglund, et al., 2012). Não existe nenhuma pesquisa envolvendo polimorfismo no gene BMP4 e características de produção in vitro de embriões (OPU -PIVE) em vacas da raça Gir brasileira, por tanto o objetivo do presente estudo foi avaliar o grau de associação entre o polimorfismo no gene BMP4 e características de OPU-PIVE em vacas Gir. Material e Métodos O DNA foi extraído a partir de folículos piloisos por método alcalino. Foram coletados dados de 212 OPU-PIVE sessões de 50 doadoras de oócitos Gir durante os anos de 2012 e 2013 no estado do Rio de Janeiro, Brasil. As características da OPU-PIVE associadas ao marcador SNP foram: Número e proporção de complexos cumulus-oócitos viáveis (Nvcoc e Pvcoc), 2. Número e proporção de embriões clivados no dia 4 de cultura (Ncleavd4 e Pcleavd4), 3. Número e proporção de embriões transferíveis no dia 7 de cultura (Ntembd7 e Ptembd7), 4. Número e proporção de prenhezes no dia 30 após a transferência (NPrD30 e PPrD30) e 5. Número e proporção de prenhezes no dia 60 após a transferência (NPrD60 e PPrD60). A reação em cadeia da polimerase de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (PCR-RFLP) foi utilizada para a genotipagem de amostras amplificadas. Para confirmar a reação de digestão, o produto foi separado em gel de poliacrilamida (8%) e corado com nitrato de prata. Após esta visualização, as amostras foram submetidas à eletroforese capilar, usando o equipamento Fragment  Analyzer™ (Advanced Analytical) para a discriminação alélica por tamanho e identificação  do polimorfismo. A associação entre o marcador de DNA, e características da OPU-PIVE e taxas de prenhez foi determinada pela análise de variância de dados repetidos utilizando o procedimento PROC GLIMMIX do SAS (2009).  Resultados e Discussão O gel de eletroforese capilar e o eletroferograma da mutação G>T no gene BMP4 são mostrados na Figura 1. Os alelos de 75pb e 105bp foram obtidos após clivagem com a enzima de restrição; o alelo mutante não foi clivado porque o local de reconhecimento estava ausente e o tamanho do alelo foi 187bp, portanto, conclui-se que a mutação encontrava-se em heterozigose.  Três genótipos foram identificados (GG, TT e GT) com frequências genotípicas de 0.64, 0.32 e 0.04, respectivamente. A análise de variância do Polimorfismo sobre as características de OPU-PIVE e as taxas de prenhez no lócus analisado no gene BMP4 mostrou efeito significativo para o genótipo (GT) nas características número e proporção de complexos cumulus-oócitos viáveis (Nvcoc e Pvcoc) e, proporção de prenhezes aos 30 dias (PPrD30). Médias para o genótipo GT apresentaram desempenho inferior nas características acima anotadas no nível de probabilidade de 1%.    Figura 1. Gel de eletroforese capilar (A) e eletroferograma (B) de PCR-RFLP O genótipo GT mostra dois fragmentos para o alelo clivado (75pb e 105pb) e um no alelo não clivado 187pb. (Mutação em heterozigose).    XXIV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA Universidade Federal do Espírito Santo Vitória ES, 12 a 14 de maio de 2014 A Zootecnia Fazendo o Brasil Crescer  www.zootec.org.br   3 Os animais com a mutação G > T no gene BMP4 apresentaram 4.29 oócitos viáveis a menos em comparação com o genótipo GG, 16.23% menor proporção de oócitos viáveis que o genótipo TT, e os embriões transferidos de vacas com genótipo GT tiveram 26.5% menor taxas de prenhez aos 30 dias, em comparação com o genótipo TT.  Li, et al., (2012), utilizando modelo in vitro em vacas Holandesas mostraram resultados similares para a mutação G>T no gene BMP4. Eles concluíram que os embriões produzidos a partir de vacas genótipo TT apresentaram 10.5 e 16.1% taxas de blastocistos mais altas do que as vacas GG e GT, respectivamente. Os mesmos autores mostraram que a taxa de blastocistos foi significativamente associada com SNP rs109778173 de BMP4 (P = 0.006), enquanto que a associação com a taxa de fertilização não foi estatisticamente significativa (P = 0.095).   Conclusões A associação entre o polimorfismo do gene BMP4 e características de OPU-PIVE em bovinos da raça Gir estudados, confirmaria a influência deste gene no desenvolvimento do embrião e nas taxas de fertilização após a transferência de embriões.  O genótipo GT afetou negativamente as características como o número e proporção de complexos cumulus-oócitos viáveis, e proporção de prenhezes no dia 30 após a transferência na população estudada. Este achado poderia ser uma indicação de um efeito genético nessas características. A mutação sinônima G>T no gene BMP4 deve ser estudada para elucidar os mecanismos envolvidos na alteração dos índices de desenvolvimento embrionário e de prenhez em vacas da raça Gir doadoras de oócitos da citada população.      Literatura citada LA ROSA, I., CAMARGO, L. S.; PEREIRA, M. M., FERNANDEZ-MARTIN, R., PAZ, D. A., & SALAMONE, D. F. Effects of bone morphogenic protein 4 (BMP4) and its inhibitor, Noggin, on in vitro maturation and culture of bovine preimplantation embryos. Reproductive Biology and Endocrinology, 9:18. . (2011). LI, G.; KHATEEB,K.; SCHAEFFER, E.; ZHANG. B.; KHATIB, H. Genes of the transforming growth factor-beta signaling pathway are associated with pre-implantation embryonic development in cattle. Journal of Dairy Research. 79 310–317, (2012) PONTES, J., NONATO-JUNIOR, I., SANCHES, B., ERENO-JUNIOR, J., UVOA, S., BARREIROS, T., et al. Comparison of embryo yield and pregnancy rate between in vivo and in vitro methods in the same Nelore (Bos indicus) donor cows. Theriogenology, 71 690–697, (2009). CANAVEZ, F., LUCHE, D., STOTHARD, P., LEITE, K., SOUSA-CANAVEZ, J., PLASTOW, G., e outros . Genome sequence and assembly of Bos indicus. Journal of Heredity, 103, 342–348, (2012). Höglund, J. K., Guldbrandtsen, B., Lund, M. S., & Sahana, G. Analyzes of genome-wide association follow-up study for calving traits in dairy cattle. BMC Genetics , 13:71,(2012).    

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/1008566/1/SP6568.pdf

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