BARCELOS, S. C. de

EGITO, A. S. do

MORAES, G. M. D.

SANTOS, K. M. O. dos

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Viabilidade de Lactobacillus rhamnosus 1127 e Lactobacillus plantarum 270, Liofilizados Após Fermentação em Leite Caprino   Samuel Carneiro de Barcelos1 Georgia Maciel Dias Moraes2 Karina Olbrich dos Santos3 Antônio Sílvio do Egito3  1Discente do IFCE – Campus Sobral, Bolsista PIBIC/CNPq/Embrapa. 2Doutoranda da Rede Nordeste de Biotecnologia RENORBIO/Docente do IFCE – Campus Sobral. georgiamoraes@yahoo.com.br 3Pesquisador da Embrapa Caprinos e Ovinos, Sobral – CE.    Resumo O uso industrial de lactobacilos como culturas iniciadoras para a indústria de alimentos depende de tecnologias de preservação necessárias para garantir a entrega de culturas estáveis em termos de atividade, viabilidade e funcionalidade. Métodos de congelamento e liofilização têm sido utilizados para este fim, mas estas técnicas podem resultar em efeitos indesejáveis como a desnaturação de proteínas sensíveis.O objetivo do presente trabalho foi avaliar a viabilidade de Lactobacillus rhamnosus 1127 e Lactobacillus plantarum 270 liofilizados em leite de cabra fermentado, submetidos a diferentes temperaturas de armazenamento, visando a produção de fermentos lácteos para uso em produtos fermentados. As cepas bacterianas foram cultivadas em leite de cabra desnatado, que foi liofilizado e armazenado a temperatura ambiente (37°C) e a -26°C. A viabilidade de ambas as cepas no produto liofilizado foi satisfatória em ambas as temperaturas testadas pois durante o período de armazenamento de 90 dias, os microrganismos apresentaram-se viáveis em concentração superior a 9 log UFC/mL após reativação em leite. Desta forma pode-se concluir que o leite de cabra fermentado pode ser utilizado como crioprotetor durante a liofilização das cepas 1127 e 270, bem como o armazenamento do fermento liofilizado pode ser realizado a temperatura ambiente ou de congelamento, por 90 dias.   Palavras-chave: Bactérias probioticas; sobrevivência; fermento lático  1. Introdução  As bactérias láticas tem sido largamente estudadas em virtude de sua aplicabilidade como culturas iniciadoras (starters) em diversos produtos fermentados. O uso industrial de lactobacilos como culturas iniciadoras para a indústria de alimentos depende de tecnologias de preservação necessárias para garantir a entrega de culturas estáveis em termos de atividade, viabilidade e funcionalidade (1). Métodos de congelamento e liofilização têm sido utilizados para este fim, mas estas técnicas podem resultar em efeitos indesejáveis como a desnaturação de proteínas sensíveis (2). Muitos compostos têm sido testados para melhorar a viabilidade e sobrevivência de bactérias láticas durante a liofilização. Os crioprotetores agem diminuindo o ponto de congelamento do sistema e reduzem a quantidade e o tamanho dos cristais de gelo durante a redução da temperatura, contribuindo para a proteção física das membranas celulares e impedindo o aumento da concentração do produto no congelamento (3). Para tanto o meio no qual o fermento será liofilizado deverá ser testado, pois cada microrganismo possui um comportamento frente aos diferentes crioprotetores.  O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade de Lactobacillus rhamnosus 1127 e Lactobacillus plantarum 270 liofilizados em leite de cabra fermentado após armazenamento em diferentes temperaturas, visando a produção de novos fermentos láticos.  2. Metodologia  Para a realização do experimento foram selecionadas as cepas Lactobacillus rhamnosus 1127 e Lactobacillus plantarum 270, isoladas de leite e queijos artesanais do Vale do Jaguaribe (Ceará), que fazem parte da Coleção de Microrganismos de Interesse para a Agroindústria Tropical, da Embrapa. As atividades foram desenvolvidas no Laboratório de Ciência e Tecnologia de Alimentos (LCTA) da Embrapa Caprinos e Ovinos, em Sobral - CE. Para a produção do fermento, a cepa foi ativada em caldo MRS (Oxoid) com incubação a 37°C por 24h. Em seguida transferiu-se 100 l da cultura ativada para 10mL de caldo MRS, seguida de incubação a 37ºC por 20h. O material foi centrifugado a 10.000rpm durante 15min em centrífuga refrigerada (4°C) (Eppendorf, 5810 R) e o pellet obtido foi lavado em 10ml de solução salina a 0,85% e centrifugado sob as mesmas condições. O pellet foi então inoculado em 100ml de leite de cabra desnatado (0,5%), previamente pasteurizado a 90ºC/15 min e incubado a 37ºC/24h. Os leites fermentados com as cepas 1127 e 270 foram acondicionados em porções de 10ml, congelados em nitrogênio liquido (-180ºC) e liofilizados (Liofilizador de bancada Enterprise I, Terroni®) durante 48 horas. Os fermentos liofilizados foram armazenados durante 90 dias a -26°C e 37°C. Para avaliar a viabilidade dos microorganismos, suspendeu-se o fermento liofilizado em 40 ml de leite pasteurizado e submeteu-se à incubação a 37ºC por 24h. Em seguida realizou-se diluições decimais do produto, seguida de semeadura em profundidade em MRS ágar (Oxoid®) acidificado a pH 5,4 com ácido acético glacial. Procedeu-se com a incubação das placas em anaerobiose (Sistema de Anaerobiose Anaerogen, Oxoid®) a 37ºC por 24h.   3. Resultados e Discussões  A concentração de células viáveis no leite após a liofilização (dia 1) e depois de 90 dias de armazenamento em diferentes temperaturas é apresentada na tabela 1. Verificou-se que a viabilidade dos fermentos lácteos liofilizados foi satisfatória, pois após o período de armazenamento de 90 dias em ambas as temperaturas testadas, os microrganismos apresentaram-se viáveis, atingindo contagens superiores a 9 log UFC/ml após reativação em leite.  Tabela 1 - Populações de L. rhamnosus 1127 e L. plantarum 270 durante 90 dias de armazenamento a 37ºC e -26ºC.   Tempo (dias) Viabilidade (log UFC/ml)  1127 (37ºC) 270 (37ºC) 1127 (-26ºC) 270 (-26ºC) 1** 8,98 8.92 8,98 8.92        90 9,01 9,15 9,32 9,71 * **  Análise realizadaapós a ativação e fermentação em leite de cabra a 37ºC/24h.                     Os fermentos preparados com base na fermentação do leite e liofilização da base fermentada favoreceram a manutenção da viabilidade dos microrganismos durante todo o período de armazenamento. Embora (5) afirmem, em seu trabalho, que culturas liofilizadas possuem mais viabilidade se, durante o armazenamento, forem submetidas a microencapsulação ou imobilizada em polímeros, os resultados aqui apresentados para a temperatura ambiente foram superiores, em média 1 log, aos encontrados pelos autores ao avaliarem L. rhamnosus R011 liofilizados com adição de polímeros gelatina, maltodextrinas e goma xantana armazenados a 20°C, durante 12 meses.  Embora o período de estocagem avaliado no presente trabalho tenha sido bastante inferior, os resultados obtidos indicam que o uso do leite propicia uma adequada manutenção da viabilidade das cepas estudadas.  A sobrevivência de um microrganismo é influenciada pela espécie e não de forma generalizada pelo polímero utilizado como crioprotetor (5). Esta afirmação fortalece a recomendação de se avaliar o crioprotetor mais eficaz para cada microrganismo a ser liofilizado.  Com base nos resultados, é possível afirmar que a liofilização das cepas 1127 e 270 em leite de cabra fermentado apresentou bons resultados, assim como os encontrados por (6) ao estudarem a viabilidade e atividade de Lactobacillus plantarum liofilizados em diferentes crioprotetores como sacarose, lactose e gelatina e leite em pó desnatado, sendo que os microrganismos inoculados em leite em pó apresentaram 100% de viabilidade após liofilização.   4. Conclusão  O leite de cabra fermentado pode ser utilizado como crioprotetor durante a liofilização das cepas 1127 e 270, bem como o armazenamento pode ser realizado a temperatura ambiente ou de congelamento, por 90 dias.   5. Referencias   1. CARVALHO, A. S., SILVA, J., HO, P., TEIXEIRA, P., MALCATA, F. X., & GIBBS, P. Impedimetric method for estimating the residual activity of freeze-dried Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. International Dairy Journal, 13(6), 463–468, (2003).  2. LESLIE, S. B., ISRAELI, E., LIGHTHART, B., CROWE, J. H., & CROWE, L. M. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying. Applied and Environmental Microbiology, 61(10), 3592–3597, (1995).  3.  ANDRADE, L. M. Avaliação de formas de preparação de estoques de trabalho na preservação de Streptomyces clavuligerus visando a produção de ácido clavulânico. São Carlos, Agosto, Collections, 2002, n.1, v.3,p.25-32 de 2008  4. CHAMPAGNE, C. P., GARDNER, N., BROCHU, E. & BEAULIEU, Y. The freeze-drying of lactic acid bacteria. A review.Can. Inst. Food Sci. Technol. J., 24, 118-128, (1991).  5. CHAMPAGNE, C. P.; RAYMOND, F. M. Y & DENIS ROY.Effect of polymers and storage temperature on the stability of freeze-dried lactic acid bacteria. Food Research International, Vol. 29, Nos S-6, pp. 555-562, 1996.  6. TSVETKOV, TS.; BRANKOVA, R. Viability of Micrococci and Lactobacilli upon Freezing and Freeze-Drying in the Presence of Different Cryoprotectants. Cryobiology 20, 318-323,1983.  6. Agradecimentos  Os autores agradecem à CNPq/Embrapa pelo suporte financeiro. 

Viabilidade de Lactobacillus rhamnosus 1127 e Lactobacillus plantarum 270 liofilizados após fermentação em leite caprino.

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