ALENCAR, M. M. de

NUNES, H. de O.

OLIVEIRA, M. C. de S.

REGITANO, L. C. de A.

ROFRUGUES, T. de O.

RUSSO, M. S.

SILVA, A. M. da

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DETECÇÃO DE Babesia bovis E Babesia bigemina PELA TÉCNICA DE N-PCR EM BOVINOS DE DIFERENTES GRUPOS GENÉTICOS M. C. OUVElItA, DESENA/., L. DEALMEIDA-REGITANO, CORREIA1; M. DEÁLENCAR, MELLd; A. M., SILVA2, M. STEIN Russo 3, T. DE OLIVEIRA RODRIGUES4 , H. DE OLIVEIRA, NUNES4 !Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos, SP, Brasil, 2 Ufscar, 3 UnB, 4'Unesp, Botucatu. marcia@cppse.e.mbrapa.br RESUMO As taxas de infecção por Babesia bovis e Babesia bigemina foram estimadas em bovinos de diferentes grupos genéticos, criadas em área de est.abilidade endêll'jca do Estado de São Paulo - Brasil. Amostras de sangue obtidas de 212 animais foram usadas para determinar o volume globular (VG) e extração de DNA Todas as amostras de DNA foram submetidas a amplificação por PCR e N-PCR para B. bovis e B. bigemina. As taxas de infecção foram altas e não diferiram significativamente (P>O,05) nos grupos genéticos estudados. Não foram observadas associações entre presença de hemoparasitas e valores de VG. Os resultados das reações de PCR e N-PCR indicaram que a disponibilidade de DNA parasitário foi inversamente proporcional à idade dos animais. PalalTas chave: Babesia bu~'is, Babesia bigenwla, suscetibilidade genética, PCR, N-PCR. ABSTRACT The illfectioll rates for Babesia bovis e Babesia bigemina were estimated ill cattle of differellt gelletic groups from a endemic area ofbabesiosis in São Paulo State - Brazil. Blood samples obtained from 212 animais were used for detennination of packed cell volwlle (PCV) and DNA extraction. Ali of the extracted DNA samples were submitted to amplification by peR .md N-PCR for B. bm.'is e B. bigemir.a. The infection rates were high and did not differ significautly (P>O,05) in the genetic groups studied. Associations between the presence ofhemoparasites and PCV values were not observed. The results of PCR and N-PCR reactions indicated that the availability of parasitic DNA was contrariwise proportional of age of the animals. Key wQrd: Babesia bovis, Babesia bigemina, breed susceptibility, PCR, N-PCR. INTRODUÇÃO No Brasil as babesioses bovinas ocorrem predominantemente sob a forma de endemia estável. Se por um lado a resistência dos bovinos de mças zebuínas às babesioses constitui uma das razões pelas quais estes animais mantêm altos índices de produtividade sob condições de endemicidade, a alta resistência que apresentam contra os carrapatos pode influir na taxa de inoculação (Uilenberg, 1995). Cruzamentos de mças zebuínas e taurinas podem originar animais suscetíveis a cepas virulentas desses protozoários (Bock et al., 1997). Como a detecção de portadores sadios, depende de métodos de diagnóstico mais sensíveis (Bõse, 1995, Oliveira, 2002) as técnicas da Rcação em Cadeia da Polimerase (PCR) e "nested" PCR (N-PCR) foram utilizadas no presente estudo, com a finalidade de verificar se existem diferenças nas prevalências desses protozoários em fêmeas zebuínas e cruzadas. M..4.TERiÂL E MÉTODOS Foram colhidas amostras de sangue de 212 fêmeas (52 Nelore, 55 Canchim/Nelore, 54 AngusINelore e 52 SimentallNelore), divididos em 3 classes de idade: 9 a 15 meses (classe 1), de 16 a 50 meses (classe 2) e de 51 meses a 72 meses (classe 3). O volume globular foi determinado pela técnica do microhematócrito. O DNA foi ell..iraído utilizando-se o kit GFX (Amersham Biosciences) e as reações de amplificação foranl realizadas conforme Figueroa et ai., (1993). Foram consideradas positivas as amQst.r<lS cujos [r<lgmeníos amplllicados apresentar<lm iaman1to de 278 pb pat"<l B. bigemina e 350 pb pat"<l B. bovis. As amostras negativas foram submetidas a segunda reação (N-PCR) e foram considerados positivas as amostras que apresentaram 656 fragmentos com 170 pb e 290 pb para B. bigemina e B. bovis, respectivamente. A análise estatística foi realizada utilizando-st o procedimento GLM do SAS (1996). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os vaiores do VG variaram entre 30 e 48% e não houve associação entre esses dados e resultados de PCR e N~PCR As freqüências de infecções por B. bovis e B. bigemina determinadas por amplificação de DNA, foram altas e semelhantes (P>0,05) nos quatro grupos genéticos, assim como nas três faixas etárias avaliadas, confirmando a condição de endemia estável da região estudada (Oliveira et ai., 2005). Considerando~se o nível de sensibilidade das reações de PCR e N-PCR, verifica-se que a disponibilidade de DNA de B. bovis e de B. bigemina foi inversamente proporcional à idade dos animais (P<0,05), conforme apresentado na Tabela 1. Para Babesia bovis, apenas um animal foi negativo após a N-PCR Os resultados dos testes de peR e N-PCR para B. bigemina, fOTanl semelhantes aos observados para B. bovis e mostraram novamente associação signillcativa pelo teste de qui-quadrádo entre idade e parasitemia. Tabe!a 1. Detecção de B. bo.,/is e B. bigemil10 em sa..'1gue de 212 bovL.'1oS de diferentes gPJPOS ge..'tléticos por amplificação do D~rA. (pCR.'1'J-idade (meses) 9 a 15 16-50 51-72 PCR(%) 82,5 12,8 O PCR)*. B. bovis N-PCR(%) 16,7 87,2 99,5 B. bigemina PCR(%) N-PCR(%) 88,6 11,4 23,5 74,4 O 92,3 *A sensibilidade estimada para os testes de PCR e N-PCR paraB. bigemina correspondeu a parasitemias de 0.00003% e 0.0000003%, respectivamente. ParaB. bovis, essa sensibilidade corre.1JOndeu a parasitemias de 0.000017% (PCR) e 0.0000017%, (N-PCR). A necessidade de uma segunda reação de PCR (N-PCR) foi fundamental para detecção de todos os portadores, como já observado anteriormente (Oliveira, 2002., Oliveira et ai.. 2005). Considerando-se apenas o resultado do PCR, não houve efeito significativo do resultado do diagnóstico para as duas espécies de protozoários sobre o hematócrito, dentro de classe de idade. Este resultado sugere que o limiar de parasitemia a partir do qual o PCR detecta a presença do parasita no sangue não permite descriminar entre aqueles que sofrem ou não os efeitos da parasitose. Embora seja reconhecida a maior resistência dos bovinos de origem zebuína às babésias (Bock et a/., 1997), os dados mostraram que ela não se traduz em menor parasitemia e que todas as raças contribuem de maneira similar para a manutenção da endemia. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Rock, RE., de VOs, A.J., Kingston, T.G., Me Lellan, D.J,1997. Effect of breed of catle on innate resistance to infection with Babesia bovis, Babesia bigemina, fJ11dAnaplasma marginale. Aust. Veto J., 75 (5), 337-40. Bose, R, Jorgensen, W.K, Dalgliesb, RJ., Friedboff, K T., DeVos, AJ., 1995. Current state and future trends in the diagnosis of babesiosis. Vet Parasitol. (57),61-74 . Figueroa. J. V.; Chieves, LP.; Jobnson, G.5.; Buening, G.M. 1993. Muitipiex polymerase chain reaction baseà assay for the detection of Babesia bigemina, Babesia bovis andAnaplasma marginale DNA in bovine blood. Vet. ParasitoI. 50, 69-81. Uilenberg, G.,1995. International collabomtive research significance of tick-bome hemoparasitic disease to world animal Health. Vet. Parasitol. 57, 19-41 . Oliveira, Me.S., Oliveira-Sequeira, T.C.G., Araujo-Jr. J.P., Amarante, AF.T., Oliveira, H.N., 2005. Babesia spp. Infection in Boophilus microplus engorged females alld eggs in São Paulo State, Brazil. Vet. Parasito!., 130, 61-67. SAS, lostitute loc., SASISTAT, 1996. Usel"s Guide, version6.11 , 4ed., v. 2, Cary: SAS lnstitutelnc. , 842p. 657 

Detecção de Babesia bovis e Babesia bigemina pela técnica de N-PCR em bovinos de diferentes grupos genéticos.

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