LUCIA JUNIOR, T.

MADEIRA, E. M.

MION, B.

PEGORARO, L. M. C.

SILVA, J. F. da

VIEIRA, A. D.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

 TESTE DE TOXICIDADE DE UMA SOLUÇÃO DE VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS (PIV) CONTENDO EGMME E DMSO  JANAÍNA FADRIQUE DA SILVA1; BRUNA MION2;ELISÂNGELA MIRAPALHETA MADEIRA2;ARNALDO DINIZ VIEIRA2; THOMAZ LUCIA JUNIOR2; LIGIA MARGARETH CANTARELLI PEGORARO3  1Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária- EMBRAPA –nanafadrique@yahoo.com.br 2ReproPel,Faculdade de Veterinária,Universidade Federal de Pelotas –brunamion@veterinaria.med.br;elisangelamadeira@yahoo.com.br ;vieira_ad@yahoo.com.br; tomjr2004@yahoo.com.br 3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária- EMBRAPA  – ligia.pegoraro@embrapa.br   1. INTRODUÇÃO  A produção in vitro de embriões é uma tecnologia de reprodução assistida que visa à multiplicação de animais superiores geneticamente nos rebanhos. Consiste de três etapas: maturação in vitro dos oócitos obtidos (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV). A criopreservação de embriões produzidos pela PIV é fundamental para tornar esta tecnologia mais abrangente. Entretanto os embriões PIV apresentam uma menor crio-tolerância frente aos métodos de criopreservação tradicionais. O método que tem demonstrado melhores resultados é a vitrificação, que consiste em submeter os embriões a altas concentrações de crioprotetores com a finalidade de aumentar a viscosidade dos meios intra e extracelulares seguidas da imersão direta em nitrogênio líquido. Sendo assim, torna-se possível resfriar os embriões rapidamente desidratando-os, e passando-os do estado líquido ao estado vítrio (gel amorfo) sem a formação de cristais de gelo intra e extracelular (KASAI et al., 1996). A solução crioprotetorea mais utilizada nesta metodologia é composta de Glicerol (GLI), Etileno glicol (EG) e Dimetil Sulfóxido (DMSO). O EG tem sido amplamente utilizado principalmente devido ao seu baixo peso molecular quando comparado a outros crioprotetores, proporcionando rápida entrada e saída na célula durante o período de equilíbrio e rehidratação(VOELKEL E HU, 1992).O etilenoglicol é o menos tóxico, seguido pelo glicerol e propilenoglicol (RUMPF et al., 2004). Nesse contexto, o aperfeiçoamento destas biotécnicas, através da utilização de uma solução crioprotetora que forneça maior viabilidade embrionária se justifica. TAKAGI et al.(1994) verificando a viabilidade de embriões bovinos no descongelamento constatou que o Etilenoglicol mono metil éter (EGMME) não altera a viabilidade embrionária. Com isso o teste de toxicidade é o primeiro passo para a utilização do EGMME como uma nova solução crioprotetor.  O objetivo do trabalho foi verificar a toxicidade da solução crioprotetora composta por EGMME-DMSO e EG-DMSO, utilizando quatro grupos de exposição ao EGMME associado a 20% de DMSO ou a 15%, para a criopreservação de embriões bovinos.  2. METODOLOGIA  Para a produção in vitro dos embriões Bovinos foram executadas as seguintes etapas.   Maturação In Vitro - Como fonte de complexos cumulus ovócitos (CCOs) foram utilizados ovários bovinos coletados no abatedouro (Famile®). Os ovários foram transportados até o laboratório em garrafa térmica a temperatura de 24-35°C, contendo solução salina acrescida do antibiótico gentamicina. No laboratório os folículos com 3 a 8 mm de diâmetro foram puncionados com um scalp 19G conectado a um tubo cônico de 15mL ligado a um sistema de vácuo com pressão de aspiração de 10mL/min. O material recuperado dos folículos permaneceu em repouso por cinco minutos até a coleta do sedimento que foi depositado em placa de Petri para busca dos CCOs sob estereomicroscópio equipado com mesa térmica. O líquido folicular (LF) sobrenadante foi centrifugado a 2000g por cinco minutos para posterior uso na manutenção dos CCOs até o início da seleção morfológica. Os CCOs selecionados foram os com grau 1 e 2 (DELOOS et al.,1989) e foram lavados em TCM-hepes [TCM 199 + 10% de SFB] antes de serem transferidos para placa de maturação. Foram utilizados 3027 ovócitos oriundos de 523 ovários para a realização do teste de toxicidade. A maturação in vitro (MIV) foi realizada em placas de multi-poços (Nunc, Nunclon, Dn) em 400µl de meio (Bio Reprodução Anima®), acrescido de 10% de SFB. As placas contendo os CCOs foram acondicionadas em estufa a 39°C com atmosfera de 5% de CO2 em ar sob máxima umidade durante 22-24 horas de incubação.  Fecundação In Vitro - Ao final do período de MIV os CCOs foram transferidos para placa de fecundação in vitro (FIV) contendo 400µl meio de fecundação (Bio Reprodução Animal®), (PARRISH et al., 1988) previamente estabilizado em estufa. Para FIV foi utilizado sêmen congelado de um touro reconhecidamente eficiente na produção in vitro de embriões. A cada rotina foi descongelada uma palheta de sêmen para seleção dos espermatozoides pelo sistema mini-Percoll (AmershamBiosciences® AB, Uppsala, Sweden), sistema de gradiente descontínuo descrito por PARRISH et al.(1986)com modificações. Após a seleção, foi realizada a inseminação (dia zero, D0) utilizando uma dose inseminante de 1,0 x 106 espermatozoides/mL por 18 a 22 horas sob as mesmas condições da MIV.  Cultivo In Vitro - Ao final do período de FIV os prováveis zigotos foram mecanicamente liberados das células do cumulus oophorus mediante repetidas pipetagens e transferidos para os poços da placa cultivo contendo 200µl de SOFaa (Bio Reprodução Anima®), suplementado com 5% de SFB e mantido sob óleo mineral. Após 24 horas (dia 2, D2) de incubação sob as mesmas condições das etapas anteriores. Em seguida, foram colocados 1,0mL de água no espaço entre os poços das placas que foram acondicionadas em sacos plásticos impermeáveis a gases que foram selados e insuflados com 5% de CO2, 5% de O2, 90% de N2 (Vajta et al., 1997). As embalagens com as placas foram então mantidas na estufa a 39°C por mais 144 horas de incubação (dia sete, D7), quando foram coletados os embriões (blastocistos) para uso nos tratamentos experimentais.  2.1Teste de toxicidade do crioprotetor EGMME-DMSO X EG-DMSO Os embriões foram homogeneamente distribuídos para constituição de seis grupos, totalizando 681 embriões. Um grupo controle sem crioprotetor (G0) e um grupo controle de exposição a solução de vitrificação (SV) composta por 20% de Etileno glicol (EG) + 20% de Dimetil Sulfóxido (DMSO) preconizada por VAJTA et al. (1997) e quatro grupos de exposição ao EGMME associado a 20% de DMSO ou a 15%, constituindo um grupo de exposição a 10% EGMME + 20% DMSO (G10); 15% EGMME + 20% DMSO (G15) e 20% EGMME + 20% DMSO (G20). Nesta etapa, o teste de toxicidade foi realizado de acordo com a metodologia de vitrificação que prevê uma fase de estabilização em uma solução de equilíbrio (SE = 50% da  concentração SV) durante 1,0 min antes da exposição à SV por 25 segundos (VAJTA et al., 1997). Após o período de exposição ás soluções, os embriões foram banhados em solução Aquecimento e Re-hidratação, em solução de sacarore, mediante banhos sequenciais de 5 min em (AR) compostas por gradientes decrescentes de sacarose (0,4 - 0,26 e 0,16M em TCM-hepes). Após estarem acondicionados em TCM-hepes os embriões foram transferidos para as placas de CIV para cultivo suplementar de 24 horas para determinação da taxa de eclosão e re-expansão determinando a sobrevivência avaliada pela capacidade de evoluir em estágios de desenvolvimento,  antes de passarem a placa de CIV, para cultivo suplementar e posterior avaliação da taxa de desenvolvimento em 24h.   3. RESULTADOS E DISCUSSÃO  Foram realizadas 6 rotinas com um total de 113 embriões, com uma média de 18.91 rendimento global por tratamento/rotina. Obteve-se uma taxa de clivagem dos embriões de 80,22% e uma taxa de desenvolvimento embrionário de 24,07%. No teste de normalidade a distribuição foi normal onde podemos realizar uma análise de variância, através do programa Statistix®. A variável avaliada foi à taxa de eclosão dos embriões após a exposição aos crioprotetores analisados, onde foram obtidas as seguintes médias de eclosão por tratamento nas 24hs, sendo demonstrado na tabela abaixo: Tabela 1: Taxa De Re-expansão e Eclosão Dos Embriões Nas 24hs Após A Exposição Aos Crioprotetores TRATAMENTO MÉDIA RE-EXPANSÃO % MÉDIA ECLOSÃO % Total T1 controle s/ criop. 53.04 34.10 87.14 T2 20% EG+20% DMSO 47.86 34.15 82.01 T3 20% EGMME+15% DMSO  44.18 35.76 79.94 T4 15% EGMME+15% DMSO 52.14 29.06 81.20 T5 15% EGMME+20% DMSO 47.76 30.30 78.06 T6 10% EGMME+20% DMSO 42.63 24.44 67.07  A partir desta tabela, foi possível observar que não houve diferença estatística (P> 0.05) entre as diferentes concentrações de crioprotetores, aos quais os embriões foram expostos. A toxicidade para as células não depende apenas das propriedades químicas dos crioprotetores, mas também do estágio de desenvolvimento embrionário (RUMPF et al., 2005). Estudos relataram que os embriões PIV são mais sensíveis à criopreservação do que os produzidos in vivo e que a crio tolerância reduzida está associada ao alto conteúdo lipídico presente no citoplasma desses embriões (ABE et al., 2002; MUCCI et al., 2006). Embriões cultivados in vitro na ausência de SFB são mais criotolerantes que aqueles cultivados em meio contendo soro (SEIDEL JR., 2006), porém neste experimento foi utilizada uma concentração reduzida de soro durante o cultivo (5%). CABRITA et al.(2003) relataram que, devido à baixa toxicidade, o dimetilsulfóxido (DMSO) seria um bom crioprotetor para embriões. No entanto, segundo RODRIGUES et al.(2008), a elevada concentração de DMSO não pode ser tolerada pela maioria das células. FAN et al. (2009) em estudo para vitrificação de células endoteliais corneanas, verificou que o EG foi o melhor crioprotetor, em concentração de 52% na solução de  vitrificação, apresentando melhor resultado isolado do que em conjunto com os outros crioprotetores testados, entre eles o EGMME. No entanto, TAKAGI et al.(1994), verificou que o reaparecimento da blastocele e ampliação de blastocistos após 48hs não foram alterados em embriões congelados com EGMME 1,3M e com EG 1,8M,e as taxas de eclosão foram superiores em comparação aos outros crioprotetores testados. 4. CONCLUSÕES  De acordo com os resultados encontrados podemos concluir que Etileno Glicol Monometil Éter possui semelhante resultado de sobrevivência dos embriões tanto em menor ou igual concentração, comparado com Etileno Glicol produto já utilizado associado ao DMSO como constituinte das soluções de vitrificação, o que nos remete uma possibilidade deste produto ser testado no processo de vitrificação.   5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABE, H.; OTOI, T.; TACHIKAW, S. Accumulation of cytoplasmic lipid droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different systems using serum-free or serum-containing media. Mol. Repro d. Dev., v.61, p.57-66, 2002.   CABRITA  E. et al., Effect of different cryoprotectants and vitrificant solutions on the hatching rate of turbot embryos (Scophthalmusmaximus), Cryobiology 47, 204–213, 2003. DE LOOS F. et al.,T.A..Morphology of immature bovine oocytes,Gamete Res., v.24, p.197-204, 1989. FAN W.;MA X.;GE D. et al.,Cryoprotectantes for the vitrification of corneal endothelial cells.Cryobiology 58, 28-36,2009. KASAI, M.,Simple and efficient methods for vitrification of mammalian embryos. Anim. Reprod. Sci., v. 42, p. 67-75, 1996.  MUCCI N.; ALLER J.; KAISER G.G.; HOZBOR F. et al., Effect of estrous cow serum during bovine embryo culture on blastocyst development and cryotolerance after slow freezing or vitrification. Theriogenology,65:1551– 62,2006. PARRISH J.J. et al.,Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen,Theriogenology 25, 591-600,1986. PARRISH J.J., SUSKO-PARRISH J., WINER M.A. and FIRST N.L., Capacitation of bovine sperm by heparin. Biology of Reproduction 38, 1171-1180, 1988. RODRIGUES. P J.;PARAGUASSÚ-BRAGA  F.H.; CARVALHO L. et al., Evaluation of trehalose and sucrose as cryoprotectants for hematopoietic stem cells of umbilical cord blood, Cryobiology 56 , 144–151, 2008. RUMPF R.;BRANDÃO D.;PEREIRA D. et al.;Vitrificação de embriões produzidos in vitro [Workshop],Brasília:Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,2004. RUMPF R.;BEM A.;PEIXER M.,et al.,Trasnferência e micromanipulação de embriões nas espécies bovinas e eqüinas [Manual], Brasília:Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2005. Statistix®.Statistix 9 analytical software. Tallahassee, FL, USA. 2008. SEIDEL JR.,  Modifyong oocytes and embryos to improve their cryopreservation. Theriogenology, v.65, p.228-235, 2006. VAJTA G.; HOLM P.; GREVE T.; CALLESEN H., The submarine incubation system, a new tool for in vitro embryo culture: A technique report.Theriogenology 48, 1379-1385, 1997. VOEKEL, A.; HU, Y.X..Direct transfer of frozen thawed bovine embryos.Theriogenology, v.37, p.23-37, 1992. 

Teste de toxicidade de uma solução de vitrificação de embriões bovinos (PIV) contendo EGMME E DMSO.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/1000991/1/CA02743.pdf

Teste de toxicidade de uma solução de vitrificação de embriões bovinos (PIV) contendo EGMME E DMSO.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa