FARINAS, C. S.

SILVEIRA, E. A.

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SCREENING DE FUNGOS LIPOLÍTICOS E PRODUÇÃO DE LIPASES POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO UTILIZANDO RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS DO PROCESSAMENTO DO DENDÊE. de A. Silveira1, P.W. Tardioli2, C.S. Farinas1(1) Embrapa Instrumentação, Rua XV de Novembro, 1452, 13560-970, São Carlos, SP, erick.biotec@yahoo.com.br; cristiane.farinas@embrapa.br(2) Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), Rodovia Washington Luiz, km 235, 13565-905, São Carlos, SP, pwtardioli@ufscar.brResumo: As lipases (triacilglicerol hidrolases, EC 3.1.1.3) pertencem a uma classe de hidrolases que catalisam a hidrólise de triglicerídeos em glicerol e ácidos graxos livres. Além disso, as lipases também catalisam a hidrólise HDWUDQVHVWHUL¿FDomRGHRXWURVpVWHUHVHH[LEHPSURSULHGDGHVHQDQWLRVHOHWLYDVSRVVXLQGRXPDJDPDGHDSOLFDo}HVbiotecnológicas de grande interesse industrial. Neste contexto, o presente trabalho apresenta resultados parciais DFHUFD GD SURGXomR GH OLSDVHV SRU )HUPHQWDomR HP(VWDGR 6yOLGR )(6 XWLOL]DQGR D ¿EUD H ERUUD GH GHQGrUHVtGXRVDJURLQGXVWULDLV$SyV WULDJHPGHSRWHQFLDLVIXQJRV OLSROtWLFRVSODTXHDPHQWRVHFRQ¿UPDomRDWUDYpVGH)(6XVDQGRIDUHORGH WULJRFRPRVXEVWUDWRHyOHRGHROLYDFRPR LQGXWRUR IXQJR¿ODPHQWRVRAspergillus niger C foi selecionado para produção enzimática.Em 72h de cultivo, o fungo aprensentou os maiores níveis de DWLYLGDGH,8P/H,8PJGHSURWHtQDVWRWDLVHP¿EUDGHGHQGrXWLOL]DQGRDERUUDFRPRLQGXWRUEsta linhagem mostrou-se promissora para produção de lipases utilizando tais resíduos agroindustriais e para estabelecer a Fermentação Combinada (FC) em etapas posterioresvisando o desenvolvimento de um bioprocesso inovador para a produção de lipases, buscando também uma destinação adequada aos resíduos do processamento do dendê.Palavras-chave: lipases, dendê, fermentação em estado sólido, fermentação combinada, resíduos agroindustriais.SCREENING OF LIPOLYTIC FUNGI AND LIPASE PRODUCTION UNDER SOLID-STATE FERMENTA-TION USING AGROINDUSTRIAL WASTES FROM THE PALM OIL PRODUCTION PROCESSESAbstract: Lipases (triacylglycerol hydrolase, EC 3.1.1.3) belong to a class of hydrolases, which catalyzes the hydrolysis of triglycerides to glycerol and free fatty acids. Furthermore, lipases also catalyze the hydrolysis and WUDQVHVWHUL¿FDWLRQRIRWKHUHVWHUVH[KLELWHQDQWLRVHOHFWLYHSURSHUWLHVDQGKDYHVHYHUDOELRWHFKQRORJLFDODSSOLFDWLRQVof great industrial interest. In this context, this work presents results on the lipase production under Solid-state )HUPHQWDWLRQ 66)XVLQJ¿EHUDQGSDOPRLO UHVLGXHV DJURLQGXVWULDOZDVWHV$IWHU WKHVFUHHQLQJRISRWHQWLDOOLSRO\WLF IXQJL SODWLQJV DQG FRQ¿UPDWLRQE\66)XVLQJZKHDW EUDQ DV VXEVWUDWH DQGROLYHRLO DV LQGXFHU WKH¿ODPHQWRXVIXQJXVAspergillus niger C was selected for the enzyme production. At 72h of cultivation, the fungus SUHVHQWHGWKHKLJKHVWOHYHOVRIDFWLYLW\,8P/DQG,8PJRIWRWDOSURWHLQLQSDOPRLO¿EHUXVLQJGUDIIas inducer. This strain proved to be promising for lipase production using agro-industrial residues and to establish the Combined Fermentation (CF) in later steps for the development of a novel bioprocess for lipases production, also seeking a suitable destination for wastes from the palm oil production processes.Keywords: lipases, palm oil, solid-state fermentation, combined fermentation, agro-industrial residues.1. Introdução$EXVFDSRUWHFQRORJLDV³YHUGHV´WHPLQFHQWLYDGRDFRPXQLGDGHFLHQWt¿FDDGHVHQYROYHUQRYRVSURFHV-sos de interesse industrial que utilizem matéria-prima renovável, reduzam o consumo energético e tenham menor impacto ambiental. Neste contexto, destacam-se os processos biotecnológicos. A grande motivação pelo uso de enzimas deve-se principalmente à redução do consumo energético do processo, pois enzimas atuam em condições EUDQGDVGHWHPSHUDWXUDHSUHVVmRHjUHGXomRGRVFXVWRVQDHWDSDGHSXUL¿FDomRGRSURGXWR¿QDOSRLVGHYLGRjDOWDVHOHWLYLGDGHHHVSHFL¿FLGDGHGDVHQ]LPDVDIRUPDomRGHVXESURGXWRVLQGHVHMiYHLVpUHGX]LGD9(6&29,2012).As lipases (triacilglicerol hidrolases, E.C 3.1.1.3), enzimas capazes de catalisar reações de hidrólise, esteri-¿FDomRHWUDQVHVWHUL¿FDomRGHVWDFDPVHGHQWUHDVHQ]LPDVPDLVLQYHVWLJDGDVHFRPYDVWRSRWHQFLDOGHDSOLFDomRindustrial. Reações catalisadas por lipases podem ser usadas industrialmente para vários propósitos, incluindo a hidrólise de óleos e gorduras, síntese de ésteres de ácidos graxos como ingredientes de cosméticos ou surfactantes, produção de intermediários para síntese orgânica, entre outros (PALOMO et al., 2002).E. de A. Silveira, P.W. Tardioli, C.S. Farinas502 Ademais, como em qualquer aplicação que exige grandes quantidades de enzima, a produção de lipases depende da redução do custo para se tornar economicamente viável. A fermentação em estado sólido (FES) repre-senta uma interessante alternativa para a produção de enzimas industriais com menores custos, com a vantagem de utilizar resíduos agroindustriais como meio de cultura. Porém, a maioria da produção industrial em larga escala de enzimas usa a tecnologia de fermentação submersa (FSm) devido à maior facilidade do monitoramento e controle do processo (SINGHANIA et al., 2010). Assim, é neste contexto que é de interesse validar a potencial produção de lipases pelo processo de fermentação combinada (FC), o qual busca reunir as principais vantagens de utilização tanto da FES quanto da FSm quando se trata de bioprocessos.(VWHWUDEDOKRREMHWLYDDSURGXomRGHOLSDVHVSRUIHUPHQWDomRHPHVWDGRVyOLGRXWLOL]DQGRRIXQJR¿OD-mentoso Aspergillus niger C selecionado após triagem de microrganismos potencialmente produtores. A principal FRQWULEXLomRGHVWHWUDEDOKRIRLLGHQWL¿FDURPHOKRUIXQJRSURGXWRUGHOLSDVHHHVWDEHOHFHUXPSURFHVVRGH)(6buscando utilizar resíduos agroindustriais do processamento do dendê para posterior complementação com o de-senvolvimento da FC. 2. Materiais e Métodos2.1. Screening de fungos produtores de lipases,QLFLDOPHQWH  IXQJRV ¿ODPHQWRVRV GD FROHomR GD(PEUDSD IRUDP VXEPHWLGRV D WULDJHP HPSODFDVXWLOL]DQGRWULEXWLULQDFRPRVXEVWUDWRHPTXHVHYHUL¿FRXDIRUPDomRGHKDORWUDQVSDUHQWHDRUHGRUGDFRO{QLDHfoi calculado o índice enzimático (relação entre tamanho do halo e o tamanho da colônia). Posteriormente, foram selecionados 8 destes fungos: 3 com maiores índices enzimáticos, 2 intermediários e 3 negativos para novo plaque-amento, mas desta vez utilizando o óleo de oliva como substrato e Rodamina B (BARROS HWDO3RU¿PRVWHVWHVGHSODTXHDPHQWRVIRUDPFRQ¿UPDGRVDWUDYpVGH)(6FRPIDUHORGHWULJRFRPRVXEVWUDWRHyOHRGHROLYDcomo indutor.2.2. Fermentação em estado sólido (FES)2VH[SHULPHQWRVHP)(6IRUDPFRQGX]LGRVXWLOL]DQGRD¿EUDGHGHQGrFRPRVXEVWUDWRHDLQGDERUUDalcalina como indutor na produção de lipases – resíduos agroindustriais do processamento do óleo de dendê. A concentração do inóculo foi de 1.107HVSRURVSRUJUDPDGH¿EUDHRVFXOWLYRVIRUDPUHDOL]DGRVHPFRQGLo}HVHVWi-ticas em estufa a 30 oC, com 80% de umidade e foram acompanhados durante 96h. Todos os experimentos foram feitos em triplicata.2.3. Determinação da atividade enzimática e proteínas totais A atividade hidrolítica das lipases foi determinada pelo método de hidrólise do azeite de oliva (SOARES et al., 1999) e também foi utilizada a metodologia de hidrólise do pNPP (p-nitrofenil-palmitato) (KORDEL et al., $TXDQWL¿FDomRGHSURWHtQDVIRLIHLWDSHORPpWRGRGH%UDGIRUG3. Resultados e DiscussãoPara os testes em placas com tributirina, as melhores linhagens (que apresentaram maiores índices enzi-máticos) foram P77C5, P50B2 e Aspergillus niger 12. Já para os plaqueamentos em meio contendo óleo de oliva e Rodamina B, testes qualitativos que apenas revelam a presença ou ausência de lipases, as linhagens P75P1e P77C5 apresentaram-se negativas (ausência de lipase), enquanto que todas as outras linhagens apresentaram produção da enzima (Tabela 1). Assim como os plaqueamentos realizados por Gutarra, Castilho e Freire (2005) também VXJHUHPRVUHVXOWDGRVGHVWHWUDEDOKRHYLGHQFLDPFHUWRSHU¿OGHVHFUHomRGDVHQ]LPDVOLSDVHVHHVWHUDVHVSHORVGL-ferentes fungos: a linhagem P77C5 somente apresentou halo de hidrólise para substrato de cadeia curta (tributirina, C4) indicando uma predominância na produção de esterases, enquanto que as linhagens P18E2 e Trichoderma har-zianum apresentaram halo de hidrólise para substrato de cadeia longa (óleo de oliva, C18) indicando que produzem predominantemente lipases. Os demais fungos provavelmente sintetizam as duas referidas enzimas, com exceção do fungo P75P1 que não apresentou nenhum halo hidrolítico.&RPUHODomRDRVHQVDLRVIHLWRVHP)(6)DUHORGHWULJRXWLOL]DQGRyOHRGHROLYDFRPRLQGXWRUSDUDFRQ¿U-mação dos plaqueamentos, os extratos brutos destas 8 linhagens foram testados segundo os métodos descritos no item 2.3. Após 72h de cultivo as linhagens apresentaram atividade lipolítica máxima (Tabela 2). Não foi possível realizar o método do pNPP para as linhagens de A. niger devido aos seus extratos terem coloração escura, preju-dicando a leitura em espectrofotômetro. Os dados revelam que, quando aplicados em processos fermentativos, os IXQJRV3&H33VmRFDSD]HVGHSURGX]LUOLSDVHVUHVXOWDGRVTXHFRQÀLWDPFRPRVGDGRVGHSODTXHDPHQWRVmostrados anteriormente, inferindo que os testes de triagem em placa são um bom guia para selecionar linhagens promissoras, porém não são conclusivos, devendo-se realizar uma fermentação que comprove a produção enzimá-tica. As linhagens de A. niger apresentaram as maiores atividades dentre todas as linhagens e, assim, foi seleciona-do o fungo Aspergillus niger CSDUDSURGXomRGHOLSDVHVHP)(6XWLOL]DQGR¿EUDHERUUDGHGHQGrSCREENING DE FUNGOS LIPOLÍTICOS E PRODUÇÃO DE LIPASES POR FERMENTAÇÃO… 5037DEHOD3ODTXHDPHQWRVGRVIXQJRV¿ODPHQWRVRVXWLOL]DQGRVXEVWUDWRGHFDGHLDFXUWDWULEXWLULQDHGHcadeia longa (óleo de oliva) com Rodamina B - revelação sob luz UV.  FungosTributirina Rodamina BMédia Øc Média Øh i.e. Desvio Padrão Revelação sob UVP77C5 6,67 11,67 1,75 0,10 -P50B2 11,67 19,33 1,66 0,02 +A. niger 12 21,67 29,00 1,34 0,02 +A. niger C 26,33 29,67 1,13 0,04 +A. niger 11T53A14 21,67 24,00 1,11 0,03 +P75P1 27,00 0,00 0,00 0,00 -P18E2 19,33 0,00 0,00 0,00 +T. harzianum 48,67 0,00 0,00 0,00 +Øc= diâmetro da colônia (mm); Øh= diâmetro do halo (mm);i.e.= índice enzimático (Øh / Øc);(+) = presença de KDOROLSROtWLFRÀXRUHVFHQWH DXVrQFLDGHKDOROLSROtWLFRÀXRUHVFHQWHTabela 2. Atividade Lipolítica (U/mL) em 72h de cultivo FES-Farelo de trigo e óleo de oliva. p-NPP Óleo de olivaA. niger C - 85,33 ± 3,33A. niger 11T53A14 - 51,73 ± 7,79A. niger 12 - 27,73 ± 1,85P77C5 0,072 ± 0,004 25,6 ± 2,88P75P1 0,119 ± 0,000 19,2 ± 2,88P18E2 0,548 ± 0,072 19,2 ± 4,45T. harzianum 0,311 ± 0,005 8,27 ± 3,70P50B2 0,070 ± 0,001 6,67 ± 3,232VSHU¿VGHSURGXomRGHOLSDVHHPPHLRFRQWHQGRRVUHVtGXRVGRSURFHVVDPHQWRGRGHQGrHVWmRUHSUH-VHQWDGRVQD¿JXUDDEDL[R$SyVKGHFXOWLYRDOLQKDJHPXWLOL]DGDDSUHVHQWRXRVPDLRUHVQtYHLVGHDWLYLGDGHlipásica: 15,41 IU/mL e 58,27 IU/mg de proteínas totais. Em trabalhos anteriores(; Penha et al., 2014), a adição GHERUUDVDOFDOLQDVWDPEpPFRQGX]LXjSURGXomRGHPDLRUHVTXDQWLGDGHVGHOLSDVHUHYHODQGRVHVHUXPH¿FLHQWHPpWRGRLQGXWRUQD)(6FRPDWRUWD¿EUDGHGHQGr'HVVDPDQHLUDHPHWDSDVIXWXUDVVHUiHVWDEHOHFLGRRSURFHGL-mento de fermentação submersa para produção de lipase por A. niger C para então se iniciar os testes de produção da enzima através da fermentação combinada.   Figura 1 - (A) Atividade lipolítica (U/mL) do fungo A.niger C cultivado em FES utilizando resíduos DJURLQGXVWULDLVGRSURFHVVDPHQWRGRGHQGr%$WLYLGDGHOLSROtWLFDHVSHFt¿FD8PJGHSURWHtQDVWRWDLVGRIXQJRA.niger C cultivado em FES utilizando resíduos agroindustriais do processamento do dendê.4. ConclusõesOs testes de plaqueamentos representam um guia para triagem de fungos lipolíticos, porém não são en-saios conclusivos devendo-se realizar um processo fermentativo posterior para comprovação dos resultados. A linhagem Aspergillus niger CDSUHVHQWRXRVPDLRUHVQtYHLVGHDWLYLGDGHGHQWUHWRGRVRVIXQJRV¿ODPHQWRVRVWHV-tados em FES-Farelo de trigo sendo, assim, utilizada em FES-torta de dendê, mostrando-se bastante promissora para dar continuidade à pesquisa no intuito de estabelecer e validar o inovador processo de fermentação combinada para a produção de lipases.A) B)E. de A. Silveira, P.W. Tardioli, C.S. Farinas504Agradecimentos¬)$3(63Hj(PEUDSDSHORDSRLR¿QDQFHLURHj(PEUDSD,QVWUXPHQWDomR/DERUDWyULRGH$JURHQHUJLDpela infraestrutura cedida.ReferênciasBARROS, F. F. C. et al. Production of Enzymes from Agroindustrial Wastes by Biosurfactant-Producing Strains of Bacillus subtilis. Biotechnology Research International: 9 p. 2013.BRADFORD, M. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing princi-ple of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, n. 1-2, p. 248-254, 1976. GUTARRA, M. L. E.; CASTILHO, L. R.; FREIRE, D. M. G. Seleção de Fungos Produtores de Lipase por Fer-mentação no Estado Sólido. XV Simpósio Nacional de Fermentações (SINAFERM). Recife, PE. 2005..25'(/0HWDO([WUDFHOOXODUOLSDVHRISVHXGRPRQDVVSVWUDLQDWFFSXUL¿FDWLRQFKDUDFWHUL]DWLRQFU\V-tallization, and preliminary-x-ray diffraction data. Journal of Bacteriology, v. 173, n. 15, p. 4836-4841, 1991. PALOMO, J. M. et al. 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Twentieth Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemi-cals, 1998, p. 745-757, 1999. 9(6&29,9([WUDomRSXUL¿FDomRHLPRELOL]DomRGHOLSDVHVYHJHWDLVGHVWLQDGDVjVtQWHVHGHELRGLHVHOHpVWHUHV2012. 79 (Mestrado). Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal de São Carlos, UFSCar

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