CHAGAS, E. A.

NUNES, C. F.

PASQUAL, M.

PIO, L. A. S.

SANTOS, E. G.

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  1 DIVERSIDADE GENÉTICA DE ACESSOS DE CAMU-CAMU (MYRCIARIA DUBIA) 2 BASEADO EM MARCADORES ISSR 3  4 CLAUDINÉIA FERREIRA NUNES1; LEILA APARECIDA SALLES PIO2; MOACIR 5 PASQUAL3; EDIANARA GENEROSO SANTOS4; EDVAN ALVES CHAGAS5 6  7 INTRODUÇÃO 8 O camu-camu (Myrciaria dubia), espécie considerada silvestre é uma frutífera da família 9 das Mirtaceas encontrada na Amazônia. Apresenta  frutos ácidos, podendo ser consumidos na forma 10 de sucos, geléias, doces e sorvetes e têm elevado teor de vitamina C, excedendo em muito aos 11 apresentados pela maioria das plantas cultivadas no Brasil.  12 O conhecimento da diversidade genética existente em acessos de camu-camu é de grande 13 importância para o êxito de programas de melhoramento e para a exploração dos recursos genéticos 14 disponíveis. O estudo com marcadores moleculares Inter Simple Sequence Repeat (ISSR), tem 15 colaborado de forma significativa como ferramenta auxiliar na definição do status populacional de 16 amostras biológicas. Tais marcadores têm sido amplamente utilizados para esta abordagem, pois são 17 eficientes, reprodutíveis, rápidos e geram números elevados de polimorfismos (KURAS et al., 18 2004). Além disso, esta técnica tem um baixo custo associado. 19 No presente estudo, os marcadores ISSR foram utilizados para avaliar a variabilidade 20 genética de acessos de camu-camu.  21  22 MATERIAL E MÉTODOS 23 Folhas jovens de 94 acessos de camu-camu provenientes de populações mantidas nas 24 margens do Lago do Rei, localizado no município de Caracaraí, Roraima/RR foram coletadas e 25 armazenadas em freezer -80°C. O DNA genômico foi extraído segundo metodologia descrita por 26 Nunes et al. (2011). Para a amplificação por PCR foram utilizados 14 primers ISSR (Tabela 1). A 27 amplificação do DNA foi realizada em termociclador de gradiente (MultiGene, EUA) com volume 28                                                             1 Dra. Bolsista Pós-Doutorado, UFLA, MG, e-mail: claudineia.f.nunes@gmail.com 2 Dra. Professora pelo Departamento de Agricultura, UFLA, MG, e-mail: leilapio.ufla@gmail.com  3 Dr. Professor  Titular pelo Departamento de Agricultura, UFLA, MG, e-mail: mpasqual@dag.ufla.br  4 Bióloga, Bolsista de Apoio Técnico (FAPEMIG), EPAMIG, MG, e-mail: digeneroso@hotmail.com 5 Dr. Pesquisador da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, RR, e-mail:edvan.chagas@embrapa.br    final de 25 µL para cada reação, contendo 20 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 29 0,10% de Triton X-100, 200µM de cada trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTPs), 0,8 mM de 30 primer, 1,5 unidade de enzima DNA polimerase GoTaq Flexi (Prodimol, EUA) e 50 ηg de DNA. 31 Em PCR, as amostras foram submetidas a temperatura de 95 °C por 2 min e, em seguida, 40 ciclos 32 de amplificação. Cada ciclo submetia as amostras a 95 °C por 45 s, com temperatura de anelamento 33 variando de 47-52 °C (dependendo do primer utilizado), por 1 min e extensão de 72 °C por 2 min. 34 Após os ciclos, as amostras foram mantidas a 72 °C por 5 min de extensão final. Os produtos 35 obtidos foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1,5% com 0,2 mg mL-1 EtBr em 36 tampão TBE 1X e realizado a 100 mV por pelo menos 3 h. Os géis foram visualizados e registrados 37 pelo digitalizador de imagem UV (Uvitec, EUA). Os marcadores obtidos foram analisados pelo 38 aplicativo computacional “Genealex 6” (PEAKALL e SMOUSE, 2006) e pelo aplicativo 'Structure 39 2.3.1' (PRITCHARD et al., 2000.).  40 Tabela 1 . Nomes, sequência e referências dos primers ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) 41 Nome Sequência primer (5ˈ - 3ˈ ) Referência Nome Sequência primer (5ˈ - 3ˈ ) Referência UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT Alizadeh et al., 2008 UBC890 VHV GTGTGTGTGTGTGTT Moreno et al., 1998 UBC812 GAGAGAGAGAGAGAGAA Alizadeh et al., 2008 UBC891 HVH TGTGTGTGTGTGTG Moreno et al., 1998 UBC827 ACACACACACACACACG Alizadeh et al., 2008 VBV VBVACACACACACACAC Arnau et al., 2002 UBC850 GTGTGTGTGTGTGTGTYC Moreno et al., 1998 BDV BDVAGAGAGAGAGAGAG Arnau et al., 2002 UBC855 ACACACACACACACACYT Alizadeh et al., 2008 HBH HBHCTCTCTCTCTCTCT Arnau et al., 2002 UBC856 ACACACACACACACACYA Nascimento et al., 2010 BDB BDBCACACACACACACA Arnau et al., 2002 UBC857 ACACACACACACACACYG Alizadeh et al., 2008 GCV GCVTCTCTCTCTCTCTC Arnau et al., 2002  42 RESULTADOS E DISCUSSÃO 43 O perfil molecular gerado por quatro dos 14 primers ISSR utilizados é apresentado na 44 Figura 1 45   Figure 1. Perfil molecular dos primers ISSR em amostras de camu-camu (Myrciaria dubia) em gel 46 de agarose (1.5%). Primer UBC 810 (A); Primer UBC 812 (B); Primer UBC 890 (C) e Primer UBC 47 850 (D). M representa o marcador molecular (50 bp DNA ladder). 48 Pelas análises realizadas pelo aplicativo 'GenAlex', por meio de dispersão gráfica PCA 49 (Principal Coordenate Analysis) e pelo 'Structure' observa-se que a população de camu-camu foi 50 dividida em 3 grupos. As análises demonstram as relações de similaridade e distância genéticas 51 entre os acessos, revelando pouca variabilidade entre populações e uma maior variabilidade dentro 52 das populações. Observa-se na figura 2 que as populações mantiveram comportamento dispersivo, 53 mostrando independência e distanciamento umas das outras. Nota-se pela figura 3 que todos os 54 grupos apresentaram praticamente o mesmo grau de estruturação, uma vez que, de acordo com o 55 resultado, seus indivíduos constituintes têm influência dos demais grupos. 56  57 Figura 2. Dispersão bi-dimensional de acordo com a análise das principais coordenadas por meio do 58 software 'GenAlex'.  59  Figura 3. Estrutura genética de 94 acessos de camu-camu (Myrciaria dubia). Cada barra vertical 60 representa um indivíduo de camu-camu, e as cores representam os três grupos que foram definidos. 61 Os grupos com mais de uma cor indicam a composição genética mista deste grupo.  62  63 Os resultados gerados por primers ISSR foram valiosos pois forneceram conhecimento 64 efetivo da constituição genética de cada indivíduo dentro da população correspondente em 65 comparação com os outros indivíduos e populações. Desta forma, a chance de selecionar fenótipos 66 com melhor desempenho agronômico aumenta, não baseadas apenas em suas respostas ambientais, 67 mas também na sua constituição genética. A estimativa de divergência genética, com base em 68 marcadores moleculares ajudará a determinar se a taxa de seleção é adequada, bem como valerá 69 para manter a variabilidade suficiente para selecionar os ciclos de reprodução (AZEVEDO et al., 70 2011).  71 CONCLUSÃO 72 Coord. 2 Coord. 1 Principal Coordenadas LR1LR2LR3LR4LR6LR7Os marcadores ISSR utilizados mostrou adequação e eficiência em discriminar 94 73 indivíduos e as populações correspondentes, separando-os em três diferentes grupos e revelando a 74 variabilidade genética de cada população e seus indivíduos.  75 AGRADECIMENTOS 76 À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Ensino Superior – CAPES pela concessão 77 da bolsa de Pós-Doutorado e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – 78 FAPEMIG pelos recursos financeiros. 79 REFERÊNCIAS 80 ALIZADEH, M.; SINGH, S.K.; JHANG, T.; SHARMA, T.R. Inter Simple Sequence Repeat 81 Analysis to Confirm Genetic Stability of Micropropagated Plantlets in Three Grape (Vitis spp) 82 Rootstock Genotypes. Journal Plant Biochemistry & Biotechnology. v. 17, n.1, p. 77-80, 2008 83 ARNAU, G.; LALLEMAND, J.; BOURGOIN, M. Fast and reliable strawberry cultivar 84 identification using inter simple sequence repeat (ISSR) amplification. Euphytica, v. 129, n. 1, p. 85 69-79, 2002. 86 AZEVEDO, A.L.S.; COSTA, P.P.; MACHADO, M.A.; DE PAULA, C.M.P.; SOBRINHO F.S. 87 High degree of genetic diversity among genotypes of the forage grass Brachiaria ruziziensis 88 (Poaceae) detected with ISSR markers. Genetics and Molecular Research. v.10, n.4, p.3530-3538, 89 2011 90 KURAS, A.; KORBIN, M.; ZURAWICZ, E. Comparison of suitability of RAPD and ISSR 91 techniques for determination of strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) relationship. Plant Cell, 92 Tissue and Organ Culture, v. 79, n. 2, p. 189-193, 2004. 93 MORENO, S.; MARTIN, J.P.; ORTIZ, J.M. Inter simple sequence repeats PCR for characterization 94 of closely related grapevine germplasm, Euphytica, v.101, p. 117–125, 1998 95 NASCIMENTO, M.A.; BATALHA-FILHO, H.; WALDSCHMIDT, A.M.; TAVARES, M.G. 96 CAMPOS, L.A.O.; SALOMÃO, T.M.F. Variation and genetic structure of Melipona quadrifasciata 97 Lepeletier (Hymenoptera, Apidae) populations based on ISSR pattern. Genetics and Molecular 98 Biology, v.33, n.2, p.394-397, 2010 99 NUNES, C. F.; FERREIRA, J. L.; FERNANDES, M. C. N.; BREVES, S. S.; GENEROSO, A. L.; 100 FONTES-SOARES, B. D. F.; DIAS, M. S. C.; PASQUAL, M.; BOREM, A.; CANÇADO, G. M. 101 A. An improved method for genomic DNA extraction from strawberry leaves. Ciência Rural, v. 41, 102 n. 8, p. 1383-1389, 2011. 103 PEAKALL, R.; SMOUSE, P. E. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic 104 software for teaching and research. Molecular Ecology Notes, v. 6, n. 1, p. 288-295, 2006. 105 PRITCHARD JK, STEPHENS M.; DONNELLY P. Inference of population structure using 106 multilocus genotype data. Genetics 155: 945-959, 2000. 107 

Diversidade genética de acessos de camu-camu (myrciaria dubia) baseado em marcadores ISSR.

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Diversidade genética de acessos de camu-camu (myrciaria dubia) baseado em marcadores ISSR.

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