El estudio de la aplicación de la tecnología de alta presión en el tratamiento de la leche para la inactivación de las enzimas proteolíticas puede proporcionar un producto con alta calidad y salubridad diferencial, capaz de investir en un aumento del consumo y de valor agregado, con el fin de beneficiarse de la cadena de producción, con impactos económicos y sociales

DEL AGUILA, E. M.

PASCHOALIN, V. M. F.

PEREIRA, P. R.

PINTO JUNIOR, W. R.

ROSENTHAL, A.

SILVA, J. M.

SILVA, J. T.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

Congreso Iberoamericano de Ingeniería de AlimentosCIBIAValencia (España) 13 - 16 enero 2014 Libro deActasEditado por Pedro Fito, Ana María Andrés, Ángel Luis Argüelles y María Dolores Ortolá Vol. 2Congreso Iberoamericano de Ingeniería de Alimentos – Cibia9 Valencia (España), 13 – 16 Enero 2014  497  USO DE LOS TRA AMIENTOS TERMICO E NO TERMICO (ALTA PRESION HIDROSTATICA) PARA LA INACTIVACIÓN DE ENZIMAS BACTERIANAS METALOPROTEASES PRESENTES EN LA DEGRADACIÓN DE LECHE  Pinto Junior, W. R1, Pereira, P.R.1, Silva, J. M1, Del Aguila, E. M1, Silva, J. T1, Paschoalin, V. M. F1 And Rosenthal, A.2  1 Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.  2 Embrapa Food Technology, Rio de Janeiro, Brazil.   1 INTRODUCCIÓN A pesar del potencial presentado por la leche nutricional, productos de alta calidad sólo pueden ser producidos a partir de materias primas de buena calidad. La leche de calidad debe tener la posibilidad de tolerar la tecnología de tratamiento y se convirtió en un producto que satisfaga las expectativas de los consumidores, como atributos nutricionales, sensoriales e higiene (Ribeiro, 2010). El enfriamiento de la leche cruda en el origen de la producción y el transporte a la industria, se practica en muchas propiedades en el Brasil. Sin embargo, la aplicación de este procedimiento favorece el crecimiento de bacterias psicrotróficas. Mayoría de las bacterias psicrotróficas, Pseudomonas fluorescens, son inactivadas por pasteurización o tratamiento UHT. Sin embargo, antes del tratamiento térmico puede ocurrir, la producción de  enzimas proteolíticas resistentes al calor que puedan resultar en problemas técnicos como la formación de malos sabores, la coagulación y la reducción de rendimiento de productos lácteos. Es interesante destacar que entre las bacterias psicrotróficas, el género Pseudomonas es prevalente en la leche refrigerada. Varios estudios informan las propiedades bioquímicas de las proteasas producidas por la especie P. fluorescens asociada con el deterioro de los productos lácteos. Aprx, se llama una proteasa que pertenece a la familia de serralisina, se ha caracterizado a partir de P. fluorescens y por la codificación del gen que fue identificado en muchas culturas. Está situado dentro del operón, que puede contener genes que codifican la lipasa, inhibidores de la proteasa, la proteasa y las proteínas secretoras auto-portadoras (Liao y Mccallus, 1998; Johnson et al., 1992; Kawai et a., 1999; Ahn et al., 1999; Doug et al., 1992). El gen Aprx también se detectó en P. tolaasi, P. aeruginosa, Serratia marcescens y Flavobacterium aislado del suelo (Martins et al., 2005). La mayoría de las proteasas de Pseudomonas spp. Son uma metaloenzima monómero de 40 a 50 kDa, que comprende un átomo de zinc y de cuatro a ocho átomos de calcio (Frank, 1997; Nielsen, 2002; Stepania, 2004). Tener una actividad óptima entre 30 °C y 45 °C, con una actividad significativa a temperaturas de refrigeración (Frank, 1997) y el pH óptimo entre 6.5 y 8.0 (Chen et al., Congreso Iberoamericanao de Ingeniería de Alimentos – Cibia9 498   Valencia (España), 13- 16 Enero 2014  2003). La termorresistencia de estas proteasas es un obstáculo importante para la industria lechera (Mu et al., 2009). La alta presión hidrostática como método para procesar y conservar los alimentos, se ha estudiado desde finales del siglo XIX. Sin embargo, estos estudios se intensificaron, sólo al final del siglo pasado (Costa et al., 1999) cuando el equipo desarrollado para la industria de la cerámica se sometió a modificaciones con el fin de adaptarse a la industria alimentaria (Sangronis et al., 1997). La conservación de los alimentos por alta presión se caracteriza por un proceso no térmico donde estos son submetidos a las presiones de 150 a 900 MPascal (MPa) equivalente a 1500 hasta 9000 atmósferas (atm), respectivamente, con opciones para la variable en el tiempo, los ciclos y la temperatura del proceso, y se pueden usar solos o en combinación con otras tecnologías (Rosenthal, 2008). Este procedimiento da a la comida el aumento de la validez comercial, la inactivación de enzimas y microorganismos y, por otra parte, puede dar lugar a la capacidad de promover cambios estructurales en las proteínas, lo que provoca la alteración de la conformación, dependiendo de la presión aplicada, lo cual es a menudo beneficioso para alimentos (Rosenthal, 2008; Buckow y Heinz, 2008; Ludikhuyze et al., 2002). Por lo tanto, el estudio de la aplicación de la tecnología de alta presión en el tratamiento de la leche para la inactivación de las enzimas proteolíticas puede proporcionar un producto con alta calidad y salubridad diferencial, capaz de investir en un aumento del consumo y de valor agregado, con el fin de beneficiarse de la cadena  de producción, con impactos económicos y sociales.   2 MATERIALES Y MÉTODOS Para investigar la capacidad termo-resistente y la inactivación inducida por la presión sobre la proteasa extracelular cruda producida a partir de Stenotrophomonas maltophilia, en la que fue detectada el gen Aprx. La cepa fue aislada a partir de una planta de productos lácteos después de 72 h de crecimiento del microorganismo a 30 °C en un medio complejo (CM) que contiene peptona (5 g / L), extracto de carne (3 g / l) suplementado con 1% de leche desnatada en polvo. La cepa de P. fluorescens (CT) ATCC 13525 (cepas de referencia), fue obtenida de la colección del Instituto Nacional de Control de Calidad en Salud (INCQS) de la Fiocruz, Rio de Janeiro - RJ. 2.1 Tratamiento de Alta Presión Hidrostática Cuatro microgramos del extracto bruto fueron colocados en bolsas de plástico de la muestra (3 cm x 2 cm), sellado libres de burbujas de aire, fueron tratadas con alta presión hidrostática (Stansted Fluid Power Co.) en la unidad del laboratorio existente en el Instituto Congreso Iberoamericano de Ingeniería de Alimentos – Cibia9 Valencia (España), 13 – 16 Enero 2014  499  Embrapa Alimentación en Río de Janeiro. Fue tratada a 30° C y 300 MPa o a 600 MPa y 35 °C durante 15 minutos seguido por el almacenamiento a 4 °C hasta la determinación de la actividad de la proteasa. 2.2 Tremoressistencia El extracto en bruto fue tratado térmicamente a 63,5 °C durante 30 min e guardado enseguida a 4 °C hasta la determinación de actividad de la proteasa, con algunas modificaciones (THE, et al., 2011). 2.3 Evaluación de la Actividad Proteolítica Extracelular  Las cepas en diferentes sectores industriales fueron activados en medio complejo (CM) que contiene peptona (5 g/L), extracto de carne (3 g/L) es un medio de agar sólido y bacto (15 g/L), suplementado o no con leche desnatada en polvo para una concentración final de 1 % (w/v) a 30 °C durante 24 h con el fin de inducir la producción de la enzima propuesto por Dufour et al. (2008). El crecimiento de las células (105 UFC/ ml) fueron controlados por turbidimetría a 600 nm en un espectrofotómetro (BELphotonics, modelo SP1105, Monza, Italia, después que se inoculó en 100 ml del medio complejo a 30 °C durante 72 h con agitación (140 rpm). Al final del período de fermentación, las células se fueron colectadas por centrifugación (12.000 g durante 15 min a 4 °C) y el sobrenadante libre de células se utilizó como un extracto de enzima en bruto. La concentración de proteína fue evaluada por fluorimétrica usando el método Qubit (Invitrogen).   3 RESULTADOS En este estudio, la enzima termo-resistente, mostró una reducción de la actividad enzimática después del tratamiento térmico, como es observada con la cepa S. maltophilia y la cepa de referencia de Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525) donde mostraon una disminución de 52,8 % y 73,3 % de la actividad enzimática, respectivamente (gráfico 1). Según Teh et al., (2011) de las 52 cepas aisladas de las superficies internas de los tanques de leche cruda, productoras de enzimas termo-resistentes, veintinueve cepas aisladas produjeron únicas enzimas proteolíticas termo- resistentes, cuando fueron tratados durante a 63,5 °C durante 30 min. La mayor parte de los aislados termoresistentes productores de enzimas durante el invierno pertenecían al género Staphylococcus  aureus (85%), mientras que una mezcla de bacterias fue ailadas en verano como Serratia spp. (68%), Streptococcus spp. (12%), Staphylococcus spp. (12%) y Pseudomonas spp. (8%). La baja estabilidad térmica se observó para Bacillus sp. con actividad proteasica en la leche, la inactivación se encontró Congreso Iberoamericanao de Ingeniería de Alimentos – Cibia9 500   Valencia (España), 13- 16 Enero 2014  bajo de 50 °C y una completa inactivación después de 5 min a 80 °C (Bilbao-Sáinz, et al., 2011). Una leve disminución de la actividad de la proteasa de S. maltophilia se observó cuando la presión se incrementó en el pH 8,3 mostrando una inactivación de 14, 3% a 300 MPa y de 17,3 % a 600 Mpa (gráfico 2). Las inactivaciones parciales no parecen ser un mecanismo general ya que la inactivación proteolítica se observó cuando el extracto crudo producido por la cepa de referencia, P. fluorescens (ATCC 13525) fue utilizado en las mismas condiciones. La enzima aislada a partir de S. maltophilia fue sometida a diferentes niveles de presión (300 y 600 MPa) durante dos períodos de tiempo (0 y 15 min). La actividad caseinolítica se determinó usando azocaseına como sustrato. Según Bilbao-Sáinz, et al. (2011), la enzima parecía ser muy resistente a la presión en la leche, después de los tratamientos más severos a la temperatura inicial de 60 °C y presión de 600 MPa durante 15 min, las actividades residuales fueron superiores a 70 %. Ludikhuyze et al., (2001) también observó un pequeño aumento en la actividad de la actoperoxidase (LPO) encontrada en la leche y suero de leche debido al tratamiento de la presión. Para algunas enzimas, presiones bajas (100 - 400MPa) combinados con temperaturas moderadas mostraron que mejoran significativamente la actividad enzimática (Anese, et al., 1995; Cano, et al., 1997; Verlent, et al., 2004). Este estudio mostró que el tratamiento térmico fue más eficaz para la reducción de la actividad enzimática de la proteasa en comparación con la tecnología no térmica de alta presión hidrostática.    4 CONCLUSIÓN La actividad de la proteasa en la bacteria S. maltophilia presentó una inactivación con  300 MPa y a 600 MPa. La inactivación parcial no parece ser un mecanismo común en todas las bacterias ya que no fue observado ninguna alteración con el extracto crudo de la cepa de referencia, Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525), cuando submetidas a las mismas condiciones experimentales. También fue observado que la perdida de la actividade de la proteasa fue alterada por el cambio de temperatura, llegando a ser más drástica que cuando submetida a la alta presión.  La inactivación parcial de las enzimas proteolíticas de S. maltophilia dependía del pH, la temperatura de procesamiento y del tiempo de procesamiento. La combinación de estos factores pueden aumentar la sensibilidad de la proteasa en diferentes condiciones de presión.   Congreso Iberoamericano de Ingeniería de Alimentos – Cibia9 Valencia (España), 13 – 16 Enero 2014  501  5 REFERENCIAS Ahn, J. H.; Pan, J. G.; Rhee, J. S. Identification of the tliDEF ABC transporter specific for lipase in Pseudomonas fluorescens SIK W1. Journal of Bacteriology. v.181, p.1847–1852, 1999. Anese, M.; Nicoli, M.; Dall'anglio, G. & Lerici, C. Effect of high pressure treatments on peroxidase and polyphenol oxidase activities. Journal of Food Biochemistry, v.18, 285–293, 1995. Buckow R.; Heinz V. 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Uso de los tra amientos termico e no termico (alta presion hidrostatica) para la inactivación de enzimas bacterianas metaloproteases presentes en la degradación de leche.

Uso de los tra amientos termico e no termico (alta presion hidrostatica) para la inactivación de enzimas bacterianas metaloproteases presentes en la degradación de leche.

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