O objetivo desse trabalho foi identificar a temperatura ótima para anelamento de cada primer microssatélite, desenvolvidos para trabalhos de biologia molecular com a espécie Theobroma grandiflorum, ligados a resistência à M. perniciosa

ALVES, R. M.

NAHON, A. E.

OLIVEIRA, H. O. de

SANTOS, C. R. dos

SILVA, I. C. da

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 1    OTIMIZAÇÃO DAS TEMPERATURAS DE ANELAMENTO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES Theobroma grandiflorum PARA CARACTERIZAÇÃO DE RESISTÊNCIA À Moniliophthora perniciosa   HELLEN OLIVEIRA DE OLIVEIRA1; RAFAEL MOYSÉS ALVES2; CAROLINA RAMOS DOS SANTOS3; ILENILCE CASTRO DA SILVA4; ALAN EDIR NAHON5   INTRODUÇÃO A vassoura-de-bruxa (Moniliophthora perniciosa) é uma enfermidade que compromete a produção comercial do cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum) na Amazônia. Na tentativa de reduzir a incidência de ataques da doença, programas de melhoramento genético dessa espécie têm sido conduzidos na Amazônia Oriental (Alves, 1999) e na Amazônia Ocidental (Souza et al., 2002) e, mais recentemente, em todos os estados da região Norte. A variabilidade genética dessa espécie torna-se uma matéria-prima valiosa para ações de melhoramento em busca de genótipos mais adequados ao sistema intensivo de cultivo. Para isso, é necessário o desenvolvimento de trabalhos relativos à caracterização e avaliação para posterior seleção dos genótipos com caracteres de interesse.  Os marcadores moleculares permitem acessar a variabilidade diretamente em nível de DNA, sem influência do ambiente e não dependem da fase de desenvolvimento da planta. Por isso, os marcadores de DNA podem ser utilizados tanto em estudos de pré-melhoramento quanto na seleção assistida (Leite, et al., 2007). Para amplificar uma ilha de microssatélite, utiliza-se um par de primers, que são sequências únicas de oligonucleotídeos, homólogos as regiões flanqueadoras dos microssatélites. Assim é possível obter uma amplificação específica da região que contém a sequencia repetida, e o polimorfismo entre bandas será decorrente dos números diferentes de elementos simples repetidos. Cada segmento diferente de DNA representa um alelo daquele loco específico (Ferreira & Grattapaglia, 1996). O objetivo desse trabalho foi identificar a temperatura ótima para anelamento de cada primer microssatélite, desenvolvidos para trabalhos de biologia molecular com a espécie Theobroma grandiflorum, ligados a resistência à M. perniciosa.  2 MATERIAL E MÉTODOS Neste trabalho foram testadas diferentes temperaturas para anelamento de 30 pares de primers microssatélites específicos para o cupuaçuzeiro. Utilizou-se DNA genômico oriundo de amostras de uma progênie de irmãos completos, obtidos por meio de polinização controlada entre os clones 174 (resistente) e 1074 (susceptível). As polinizações foram realizadas na base experimental da Embrapa Amazônia Oriental, em Belém – Pará. Foram empregados 5 indivíduos para realização de cada teste. O DNA dos indivíduos foi extraído a partir de tecido foliar, utilizando-se o método do CTAB (Doyle e Doyle, 1990) com algumas modificações (Figueira et al., 2003). A quantificação do DNA das amostras foi avaliada em gel de 0,8% de agarose corado com brometo de etídio e a concentração determinada por fluorometria (DyNA Quant 2000, GE Health Care, Buckinhamshire, Reino Unido). As amostras foram ajustadas para a concentração de 5ng DNA/µl e conservadas a 4°C.   No laboratório de Genética da Embrapa Amazônia Oriental, foram feitas as reações de PCR com volume final de 13 μl, contendo 15 ng de DNA genômico, 100 μM de cada dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP); 0,2 μM de cada primer (forward e reverse); tampão da enzima (50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl pH 8,8; 0,1 % Triton X – 100; 1,5 mM MgCl2 ), 1 unidade de Taq DNA polimerase (NeoTaq DNA Polymerase Kit). Esses tubos foram submetidos a um programa de amplificação em Termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, EUA), em gradiente. Partindo-se da temperatura padrão de 55ºC utilizada para a maioria dos primers foram testadas seis temperaturas de  anelamento: T1 = 49ºC; T2 = 52ºC; T3 = 55ºC; T4 = 58ºC; T5 = 61ºC e T6 = 64ºC, para cada primer. O marcador 10 Kb Plus DNA ladder foi utilizado como referência de peso molecular para estimar os tamanhos dos produtos da amplificação.  Após a amplificação, os produtos foram separados em gel de poliacrilamida 7% e corados em uma solução de nitrato de prata e avaliados através da leitura direta das bandas no gel.      3 RESULTADOS E DISCUSSÃO A Tabela 01 relaciona os 30 primers testados e suas correspondentes temperaturas ótimas de anelamento, possibilitando a identificação do número de alelos no loco e a presença ou não de polimorfismo na população estudada. Tabela01: Representação do locus com as temperaturas ótimas de anelamento de cada primer; A: número de alelos no loco; Polimorfismo: presença ou ausência. Belém, 2014. Locus Temp. Anelamento (ºC) A Polimorfismo mTgM02 - 0* - mTgM04 - 0* - mTgM05 58 2 ** mTgM06 55 2 ** mTgM08 58 2 ** mTgM16 58 2 ** mTgM36 - 0* - mTgM40 - 0* - mTgM51 - 0* - mTgM52 58 2 ** mTgM53 - 0* - mTgM55 - 0* - mTgM56 - 0* - mTgM59 - 0* - mTgM63 - 0* - mTgM68 64 2 ** mTgM79 - 0* - mTgM84 55 2 ** mTgM85 - 0* - mTgM87 58 2 ** mTgM95 - 0* - mTgM98 - 0* - mTgM104 - 0* - mTgM105 - 0* - mTgM106 - 0* - mTgM107 - 0* - mTgM110 - 0* - mTgM111 - 0* - mTgM112 - 0* - mTgM116 - 0* - 0* Amplificação Inespecífica  **Presença de Polimorfismo; 0: ausência de polimorfismo.  Dentre os 30 pares de primers testados, 8 apresentaram amplificação no gradiente das seis temperaturas, sendo identificada a temperatura ótima para o anelamento que cada primer.  4 Regra geral, observou-se que somente nas temperaturas mais elevadas houve possibilidade de anelamento do primer ao DNA, com o consequente aparecimento das bandas no gel de acrilamida. Tiveram o melhor comportamento na temperatura de anelamento 58°C os primers mTgM 05, mTgM 08, mTgM 16, mTgM 52 e mTgM 87. Na temperatura de 55ºC os que tiveram boa amplificação foram os primers mTgM 06 e mTgM 84.  E por fim, o loco mTgM 68 com amplificação ótima à 64ºC. Nessas oito amplificações, todos os primers apresentaram polimorfismo com presença de dois alelos/loco. Vale ressaltar que o máximo de alelos esperados eram dois, visto que, o material empregado era uma progênie de irmãos completos. Os locos com amplificação inespecífica, em sua maioria, apresentaram multibandas fracas e indefinidas.   CONCLUSÕES  Foi possível determinar a temperatura ótima de anelamento de 27% dos primers testados. Os iniciadores mTgM 05, mTgM 06, mTgM 08, mTgM 16,  mTgM 52, mTgM, mTgM 68, mTgM 84 e mTgM 87, poderão ser empregados nas pesquisas de biologia molecular do cupuaçuzeiro.  REFERÊNCIAS ALVES, R.M. EMBRAPA. Centro de Pesquisa Agroflorestal da Amazônia Oriental (Belém, PA). Programa de melhoramento genético e de adaptação de espécie vegetal para a Amazônia Oriental. Belém, 1999. P.37-45. (Embrapa Amazônia Oriental. Documentos, 16). FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 2.ed. Brasília: EMBRAPA, CENARGEN, 1996. 220P. LEITE, T.L; FERREIRA. M.A; TARCHETTI. B.D. Análise de Transferibilidade de primers microssatélites de Cucumes melo para Cucurbita moschata E Luffa cylindrica. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2007. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento.  SOUZA, A. G. C. ; RESENDE, M. D. V. ; SILVA, S. E. L. ; SOUZA, N. R. The cupuaçuzeiro genetic improvement program at Embrapa Amazônia Ocidental. Crop Breeding And Applied Biotechnology, Londrina, v. 2, n. 3, p. 471-478, 2002. 

Otimização das temperaturas de anelamento de marcadores microssatélites Theobroma grandiflorum para caracterização de resistência à Moniliophthora perniciosa.

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