ALVES, M. de C.

CARNEIRO, A. A.

CARNEIRO, N. P.

GUIMARAES, A. N.

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  XXX CONGRESSO NACIONAL DE MILHO E SORGO “Eficiência nas cadeias produtivas e o abastecimento global”   Utilização de Agrobacterium rhizogenes para Produção de Culturas de Raízes de Milho    Andrea Almeida Carneiro(3); Amanda Naye Guimarães(1); Meire de Cassia Alves(2); Newton Portilho Carneiro(3).   (1)Estudante do Curso de Biotecnologia da Faculdade Ciências da Vida - Sete Lagoas / MG;  (2) Analista da Embrapa Milho e Sorgo; (3) Pesquisadores da Embrapa Milho e Sorgo.  RESUMO: Um dos métodos mais utilizados para a transformação genética de plantas é via inoculação com bactérias do gênero Agrobacterium. A transformação natural por Agrobacterium ocorre apenas em dicotiledôneas, pois monocotiledôneas não são hospedeiras naturais desta bactéria. Entretanto, nas últimas décadas novas descobertas sobre este processo de transformação têm sido acumuladas possibilitando a transformação de monocotiledôneas, como o milho (Ishida et al., 2003; Frame et al., 2006).A. rhizogenes é um patógeno responsável pela formação do fenótipo conhecido como raízes em cabeleiras ou “hairy roots”. Apesar da transformação por Agrobacterium introduzir de uma única ou poucas cópias do transgene no genoma da planta, ainda apresentam um tempo longo para estudos de plantas T1 e a necessidade de manutenção de um grande número de eventos em casas-de-vegetação certificadas para a biossegurança. Portanto, é muito importante desenvolver um modelo de transformação eficiente, simples, rápido e econômico, para linhagens de milho que permita estudos mais in vivo de um número maior de genes de interesse e/ou características associadas ao sistema radicular. Este estudo teve como objetivo avaliar a virulência de quatro linhagens de A. rhizogenes, A4, 8196, 2659 e R1601 para embriões imaturos zigóticos do milho Hi-ll. As cepas utilizadas para a infecção continham o plasmídeo binário pTF102 que contém os cassetes gênicos 35SP:: gus::35ST e 35SP::bar::vspT. Após a infecção com A. rhizogenes os embriões imaturos de milho foram transferidos para o meio de co-cultivo durante cinco dias e a expressão transiente de GUS foi utilizada para determinar a eficiência de infecção das diferentes estirpes testadas. Os genes bar e rol foram detectadas por PCR, em algumas das raízes gerados. Os resultados confirmam que as A. rhizogenes foi capaz de infectar embriões imaturos de milho Hi-II, sendo que eficiência foi maior para as cepas A4.e R1601.  Termos de indexação: Agrobacterium rhizogenes; raízes em cabeleira; transformação genética; Zea mays.  INTRODUÇÃO  A transformação genética de milho via A. rhizogenes com a consequente geração de culturas de raízes apresenta algumas vantagens sob a transformação com A. tumefaciens, para estudos de genômica de raiz: (1) Raízes adventícias transformadas podem ser geradas mais facilmente em um curto espaço de tempo (entre 2 e 4 semanas) (Xu et al., 2006); (2) Genes inseridos em plasmídeos binários podem ser co-transformados; (3) Cada raiz formada é derivada de uma única célula, o que evita a presença de quimeras nas culturas de raízes; (4) Raízes podem ser propagadas clonalmente em meio de cultivo simples; (5) Clones de raízes podem ser  mantidos indefinidamente in vitro através de repicagens sucessivas; (6) Do ponto de vista da biossegurança ambiental, culturas de raízes transgênicas são mais simples de manipular do que as plantas transgênicas; (7) Raízes geradas por A. rhizogenes têm o potencial de serem colonizadas por microrganismos simbióticos e parasíticos viabilizando estudos destas interações (Harrison e Buuren, 1995; Fortin et al., 2002; Alpizar et al., .006; Bosselut et al., 2011). O objetivo deste estudo foi definir a virulência e alguns parâmetros de infecção das cepas de A. rhizogenes A4, R1601, 2659 e 8196 para o milho. Em projetos posteriores, utilizaremos a metodologia desenvolvida para estudos de genes relacionados a estresses abióticos e bióticos em raiz, assim como para estudos de genes relacionados a interações simbióticas (fungos micorrízicos e/ou microrganismos fixadores de nitrogênio e promotores de crescimento) ou   XXX CONGRESSO NACIONAL DE MILHO E SORGO “Eficiência nas cadeias produtivas e o abastecimento global”   parasíticas (nematódeos) que acontecem nas raízes de milho.  MATERIAL E MÉTODOS  O genótipo utilizado neste protocolo é o milho HiII (Armstrong et al., 1991). A esterilização e coleta de embriões de milho foram realizadas de acordo com Petrillo et al. (2008). Para a transformação coletou-se embriões imaturos de 1,8 – 2,0 mm de comprimento (10 -12 dias após a polinização). Para esterilização as espigas foram mergulhadas em uma solução de 1:1 de água sanitária comercial e H2O destilada com 1-2 gotas de Tween 20 durante 20 minutos. Quatro estirpes de A. rhizogenes R1601, A4, 2659 e 8196, pertencentes à coleção de microrganismos da Embrapa Milho e Sorgo, foram comparadas quanto a sua eficiência de transformação de milho.  O protocolo utilizado para a transformação genética de milho foi adaptado dos procedimentos publicados por Frame et al. (2006) e Xu et al. (2006). Inicialmente A. rhizogenes foi plaqueada em meio YEP a partir de uma cultura estoque mantida em glicerol a -80oC. Para a transformação genética, foi feita uma estria da Agrobacterium utilizando uma colônia isolada, em meio YEP e incubada por 2 a 5 dias a 19oC. Antes da transformação a Agrobacterium foi ressuspendida em meio de infecção suplementado com acetoseringona e mantida sob agitação de 150 rpm a 23oC. Foram utilizados 100 embriões para cada tratamento, divididos em 5 placas, sendo cada placa considerada uma repetição. Embriões foram coletados em microtubos de 1,5 ml (50 embrião/ tubo) contendo meio de infecção. Momentos antes da infecção todo o meio foi removido e 1 ml da cultura bacteriana adicionado. Após a infecção, os embriões foram transferidos para a superfície do meio de co-cultivo (Frame et al., 2006; Xu et al., 2006), com o eixo embrionário em contato com o meio. As placas foram incubadas a 20oC por 7 dias.  Após o período de co-cultivo, 10% dos embriões foram utilizados nos ensaios histoquímicos de GUS e o restante transferido para o meio de formação de raízes (Frame et al., 2006; Xu et al., 2006) suplementado com 250 mg/l de cefotaxime a 28oC (escuro) durante 14 dias.  Raízes começaram a ser formadas nos explantes a partir da segunda semana de incubação. Quando as raízes atingiram aproximadamente 3 cm de comprimento, elas foram individualizadas e transferidas para meio MS (Murashige and Skoog, 1937) suplementado com cefotaxime.  O DNA de raízes transformadas foi extraído de acordo com Sambrook et al. (1989). As sequências dos primers rol, vir e aux  utilizados na caracterização molecular das A. rhizogenes e das raízes transgênicas foram de acordo com Alpizar et al. (2008).  As reações de PCR para a amplificação de DNA genômico foram realizadas em um volume final de 20 ul contendo 5 µM de cada primer; 1,0 µl do tampão de reação 10 X; 1,0 µl de MgCl2 50mM; 1,0 µl de dNTPs (2,5mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 0,5 U de Taq DNA polimerase. Amostras foram amplificadas usando uma desnaturação inicial de 94oC por 2 min; seguida de 30 ciclos (94oC por 15 s, 50oC por 15 s, 72oC por 15 s) e uma extensão final de 2 min a 72oC.  RESULTADOS E DISCUSSÃO  Para a transformação de embriões imaturos de milho foram utilizadas as estirpes de A. rhizogenes R1601, 2659, 8196 e A4. Primers específicos para os genes vir, rol e aux presentes no plasmídeo Ri, desenhados para a caracterização das raízes transgênicas, foram testados, inicialmente, para a amplificação do DNA genômico das A. rhizogenes.   Os genes vir se localizam na região de virulência do plasmídeo Ri e são responsáveis pela cópia e transferência à célula vegetal do T-DNA, entretanto estes genes não são transferidos para a célula vegetal. Na Figura 1 podemos observar que os primers específicos para o gene virD1 foram capazes de amplificar o DNA total das quatro cepas de A. rhizogenes utilizadas, por outro lado o par de primers para o gene virG amplificou apenas o DNA genômico da estirpe R1601.   Figura 1: Amplificação pela PCR de DNA genômico de Agrobacterium rhizogenes (1) A. rhizogenes R1601; (2) A. rhizogenes 2659; (3) A. rhizogenes 8196; (4) A. rhizogenes A4.  virD1, virG, rolA, rolB,   XXX CONGRESSO NACIONAL DE MILHO E SORGO “Eficiência nas cadeias produtivas e o abastecimento global”   rolC, rolD, aux1, aux2: primers utilizados nas reações de PCR. Os genes rol estão localizados no T-DNA do plasmídeo Ri e quando transferidos para a célula vegetal induzem a formação das raízes em cabeleira. Primers para os genes rolA foram capazes de amplificar o DNA total das bactérias R1601, 2659 e A4. Os genes rolB e rolC foram amplificados nas quatro cepas de A. rhizogenes, por seus respectivos primers. Os primers para o gene rolD amplificaram apenas o DNA genômico das bactérias R1601 e 2659.  Os genes aux são responsáveis pela síntese de auxina endógena e, também, estão localizados no T-DNA do plasmídeo Ri. As reações de PCR utilizando os primers específicos para o gene aux1, também conhecido como iaaM, amplificaram o DNA das bactérias R1601, 8196 e A4. Já as reações com os primers específicos para o gene aux2, conhecido também como iaaH, amplificaram genes nas cepas R1601, 2659 e A4.  Os pares de primers virD1, rolB e rolC, amplificaram os genes virD1, rolB e rolC no DNA das 4 estirpes de A. rhizogenes. Portanto, estes primers foram utilizados para a caracterização molecular das raízes transgênicas de milho. O gene virD1 foi utilizado como um controle para comprovar que as raízes produzidas estavam livres de contaminação por A. rhizogenes, uma vez que tal gene só auxilia no processo de transferência do T-DNA para a célula vegetal. Os primers para os genes rolB e rolC foram utilizados para a confirmação da transgenia das raízes estudadas. Os resultados da transformação genética do milho com as diferentes estirpes de A. rhizogenes podem ser observados na Figura 2 e 3. A A. rhizogenes A4 foi a que apresentou a maior eficiência de infecção de embriões imaturos de milho (Figura 2). Hongwei et al (2006) testaram as estirpes de A. rhizogenes ATCC15834, A4 e R1604 na produção de plantas de milho transgênico. Milho transgênico foi obtido após a infecção de calos com as estirpes ATCC15834 e A4.  Uma raiz originada de cada transformação com as diferentes cepas de A. rhizogenes R1601, 8196 e A4, com crescimento vigoroso em meio de cultivo, foi selecionada para os estudos moleculares. Nenhuma raiz produzida pela cepa 2659 apresentou alta taxa de crescimento, não sendo, portanto, utilizada nesta análise. O resultado da PCR realizada com o DNA extraído das raízes de milho transgênicas, utilizando os primers virD1, rolB e rolC pode ser observada na Figura 4. O primer virD1 amplificou somente o DNA total de A.  rhizogenes, sendo um resultado esperado, pois o gene virD1 não é transferido para a célula vegetal e deve ser encontrado apenas na Agrobacterium. Este resultado mostra que não existe contaminação de A. rhizogenes nas raízes analisadas.                           Figura 2 - Infecção de embriões imaturos de milho HiII com A. rhizogenes contendo o plasmídeo pTF102. (A) Estirpe A4; (B) Estirpe R1601; (C) Estirpe 8196.  DNA total das raízes selecionadas baseado no crescimento ativo na ausência de reguladores de crescimento vegetal, em meio de cultivo foi amplificado com os primers rolB e rolC, provando a natureza transgênica destas raízes (Figura 4). Spena et al. (1987) mostraram que a presença de mais de um gene rol na raiz transgênica produz um fenótipo de raiz em cabeleira mais acentuado, pois estes genes atuam de maneira sinergística. Sendo que o gene rolB é o mais eficiente na indução das raízes e quando mutado não é capaz de induzir a formação de raízes in vitro (Spena et al., 1987). Raízes transgênicas foram produzidas pelas cepas A4, R1601 e 8196. A4 e R1601 são estirpes classificadas como dos tipos agropina, enquanto que a 8196 é do tipo mannopina. Isolados produtores de agropina são eficientes na transformação de uma grande variedade de espécies de plantas e seu plasmídeo Ri contem o TL e TR-DNA (Jouanin, 1984; Huffman et al., 1984). O TR T-DNA contém genes de indução de tumor (síntese de auxina tms1 e tms2) homólogos aos do plasmídeo Ti de A. tumefaciens (Huffman et al., 1984; Jouanin, 1984) e, genes envolvidos na biossíntese de agropino (ags) (Huffman et al.,1984). Mutagênese desta região do plasmídeo Ri resulta na perda ou atenuação da virulência (White et al., 1985). Genes presentes no TL-DNA direcionam a síntese de substâncias responsáveis pela   XXX CONGRESSO NACIONAL DE MILHO E SORGO “Eficiência nas cadeias produtivas e o abastecimento global”   diferenciação das células em raízes, os genes rol (root locus) (Shen et al.,1988).  Figura 3: Formação de raízes transgênicas em embriões imaturos de milho. (A) A. rhizogenes 2659; (B) A. rhizogenes A4; (C) A. rhizogenes 8196; (D) A. rhizogenes1601 após 2 semanas de inoculação; (E e F)  Raízes transgênicas após 4 semanas em meio de cultivo GE.    Figura 4: PCR DNA raízes de milho transgênicas: (1 a 5) Amplificação pela PCR com primers para o gene virD1; (1) milho HiII A. rhizogenes  R1601; (2) milho HiII A. rhizogenes  A4; (3) milho HiII A. rhizogenes  8196; (4) A. rhizogenes DNA total; (5) controle negativo; (6 a 10) Amplificação pela PCR com primers para o gene rolB; (6) milho HiII A. rhizogenes  R1601; (7) milho HiII A. rhizogenes  A4; (8) milho HiII A. rhizogenes  8196; (9) A. rhizogenes DNA total; (10) controle negativo; (11 a 15) Amplificação pela PCR com primer para o gene rolC; (11) milho HiII A. rhizogenes  R1601; (12)  milho HiII A. rhizogenes  A4; (13) ) milho HiII A. rhizogenes  8196; (14) A. rhizogenes DNA total; (15) controle negativo. (M) Marcador mlecular lambda 1 Kb.  CONCLUSÕES  As cepas de Agrobacterium rhizogenes R1601, A4 e 8196 são capazes de transformar o milho HiII, produzindo culturas de raízes que podem ser mantidas in vitro por longos períodos de tempo.  A disponibilidade de clones de raízes de milho de longa duração in vitro será útil para os estudos de análises funcionais de genes expressos nas raízes. E também, para estudos de interações planta-microrganismos, tais como fungos micorrízicos.   AGRADECIMENTOS  Os autores agradecem à FAPEMIG e CNPq que promovem atividades de fomento, apoio e incentivo a pesquisas científicas e tecnológicas em Minas Gerais, possibilitando a realização do estudo por meio do fornecimento de auxílio financeiro, e à Embrapa Milho e Sorgo pela concessão de bolsa de estudo durante o período de realização do trabalho.   REFERÊNCIAS  ALPIZAR, E.; DECHAMP, E.; LAPEYRE-MONTES, F.; GUILHAUMON C.; BERTRAND, B.; JOURDAN, C.; LASHERMES, P.;  ETIENNE H. 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Utilização de Agrobacterium rhizogenes para produção de culturas de raízes de milho.

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