BATISTA, D. P. C.

DORNELAS, C. B.

GRILLO, L. A. L.

MAGALHAES, N. S. S.

SAOUZA, R. da S.

SENA FILHO, J. G. de

TEODORO, A. V.

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12° Congresso Brasileiro de Polímeros (12°CBPol)   FORMULAÇÕES BIOINSETICIDAS DE BEAUVERIA BASSIANA A BASE DE NANOCOMPÓSITO POLIMÉRICO VISANDO O CONTROLE DE PRAGA DO COQUEIRO  Diogo P. C. Batista1, Rafael da S. Souza1, Nereide S. Santos-Magalhães2, José G. de Sena-Filho3, Adenir V. Teodoro3, Luciano A. M. Grillo1, Camila B. Dornelas1*  1Curso de Farmácia - Escola de Enfermagem e Farmácia (ESENFAR) - UFAL- AL (dornelascb@yahoo.com.br) 2Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) - UFPE - PE 3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa Tabuleiros Costeiros - SE  Visando a produção de uma formulação capaz de proteger, promover liberação retardada, manter a viabilidade e a virulência de esporos do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana contra insetos-praga que atacam culturas de coqueiro, Rhynchophorus palmarum, foram desenvolvidas micropartículas ou pellets utilizando-se o nanocompósito polimérico alginato/bentonita como material de núcleo. Os pellets foram formados pelo gotejamento em cloreto de cálcio a partir da mistura do material de núcleo e da suspensão de conídios fúngicos em duas diferentes concentrações, séries 1 e 2. Foram avaliados: o percentual de encapsulação de conídios, o índice de intumescimento dos pellets (Ii%) e sua capacidade de liberação in vitro dos conídios da formulação. O nanocompósito mostrou ser uma potencial matriz para B. bassiana, no entanto, pelos resultados do presente estudo, concentrações intermediárias de suspensão fúngica devem ser avaliadas para se alcançar o equilíbrio entre a estabilidade dos pellets e a liberação modificada do fungo.  Palavras-chave: Beauveria bassiana. Rhynchophorus palmarum. Bioinseticida. Alginato de Sódio. Bentonita Sódica.   Introdução  A importância do agronegócio do coco é notória para a economia brasileira, especialmente para o Nordeste, onde se concentra mais de 90% da produção nacional. Cultura típica de clima tropical, o cultivo do coco é encontrado em áreas desde o estado do Pará até o Espírito Santo e, em termos de importância econômico-social, assume posição importante como atividade geradora de emprego e renda. No entanto, surtos de pragas em palmeiras, como o coqueiro, comprometem essa cultura e os prejuízos causados pela broca-do-olho-do-coqueiro Rhynchophorus palmarum aos produtores de coco têm destaque [1,2]. O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa) incentiva cada vez mais o uso de inseticidas biológicos, ou bioinseticidas, no combate às pragas nas lavouras. O Agrofit, sistema eletrônico de consulta pública do Ministério da Agricultura (MA), não tem registro de nenhum bioinseticida contra R. palmarum. Bioinseticidas a base de fungos entomopatogênicos já são amplamente utilizados no controle microbiano, mas os conídios fúngicos são muito sensíveis a fatores externos (abióticos), como calor, radiação, umidade, variações de pH, portanto sua microencapsulação é desejável, a fim de proteger a matriz fúngica desses fatores, mantendo suas principais características [3,4]. Além disto, pode vir a garantir maior aderência do produto no inseto e/ou no coqueiro, proporcionando maior eficiência na aplicação e maior estabilidade para que possa ser armazenado por um tempo maior. Assim, o presente trabalho propõe o desenvolvimento de bioinseticida de B. bassiana sob a forma de pellets de nanocompósito polimérico de alginato e bentonita de sódio como materiais de núcleo para investigação contra R. palmarum.  Parte Experimental  Obtenção da suspensão de conídios. Culturas do fungo foram obtidas a partir do semeio do isolado CPATC-032 (Embrapa Tabuleiros Costeiros) em placas de Petri contendo meio nutritivo BDA (Batata-Dextrose-Ágar) (Himedia, Índia). As placas foram mantidas em estufa (Solab, Brasil) a 26°C por 7-10 dias e fotoperíodo de 12 horas. As suspensões utilizadas nos experimentos foram preparadas a partir da raspagem de colônias do fungo com alça de platina com ponta em forma de “L” e inoculação em água destilada com Tween 80® (Sigma-Aldrich, Alemanha) a 0,02% como espalhante adesivo. Estas suspensões foram filtradas em gaze estéril para retirada do micélio e a concentração de conídios determinada em câmara de Neubauer (hemacitômetro) (New Optik, Brasil) ao microscópio óptico (Metrimpax Hungary/PZO-Labimex, Polônia).  Obtenção das formulações bioinseticidas. Os pellets de alginato ou alginato-bentonita contendo B. bassiana foram produzidos pelo gotejamento em solução de cloreto de cálcio 0,25 M (Vetec, Brasil) da suspensão obtida pela mistura dos respectivos materiais após 1 hora de agitação a temperatura ambiente [3-7]. A concentração do alginato de sódio (Sigma-Aldrich,Alemanha) foi fixada em 1%. Foram avaliadas como variáveis: a concentração de bentonita sódica (Bentec Laviosa, Itália) (0; 0,5; 2%) e a concentração de conídios (série 1: 2x107e série 2: 6x109conídios/mL), 12° Congresso Brasileiro de Polímeros (12°CBPol)  produzindo, respectivamente: ab0; ab0,5; ab2; AB0; AB0,5; AB2. Os pellets foram separados por filtração em papel filtro, lavados 3 vezes com água deionizada e secos em capela de fluxo laminar vertical (Filterflux, Brasil) [5]. Os experimentos foram realizados em triplicata.   Estimativa do percentual de encapsulação. Foi obtida por meio da diferença entre a quantidade de conídios inicial e a contagem de conídios no material residual, ou seja, presente no sobrenadante e água de lavagem.  Determinação do índice de intumescimento (”sweeling”). 50 unidades de pellets de cada formulação foram separados e pesados para obtenção do peso médio. Em seguida, esta mesma amostra foi imersa em água destilada por um período de 12 horas, seca suavemente e repesada para obtenção do índice de intumescimento (Ii%) (Eq.1), onde   é o peso dos pellets após intumescimento e   o peso dos pellets secos [6].                   Equação 1: Índice de intumescimento (Ii%).  Estudos de liberação in vitro. 10 pellets foram semeados em BDA, de forma que foram dispostos aleatoriamente em toda extensão da placa. Foi acompanhado o crescimento do fungo por observação visual da germinação miceliana [7].  Análise Estatística. Os experimentos foram conduzidos em triplicata e os dados obtidos foram tratados através de análise de variância (Anova) pelo programa GraphPad Prism 5.00.   Resultados e Discussão  A utilização de biopolímeros, com destaque para os alginatos, justifica-se por serem de fácil degradação hidrolítica e enzimática, biocompatíveis e não tóxicos. Além da capacidade de formar géis insolúveis em água através de ligações cruzadas com cátions divalentes, a exemplo o cloreto de cálcio. Contudo, estes géis apresentam uma alta porosidade, resultando em níveis elevados de difusão do princípio ativo nele contido. A associação alginato/bentonita proporciona tanto a diminuição desta porosidade quanto proteção contra quelação. Em termos gerais, a utilização de nanocompósitos polímero/argila permite um melhoramento, dentre outros fatores, das propriedades de barreira, estabilidade térmica e dimensional e de suas propriedades mecânicas [7,8]. Esta melhoria foi comprovada durante a formação dos pellets, que se mostraram mais firmes e bem definidos em misturas com concentração mais alta de bentonita, além de serem formados mais facilmente no momento do gotejamento. A reticulação da mistura biomassa fermentada/nanocompósitos poliméricos em cloreto de cálcio gerou pellets firmes, resistentes ao toque e bem definidos (Fig. 1a) na série 1, ao passo que na série 2 (Fig. 1b), onde se utilizou concentração de conídios mais elevada, eles se mostraram um pouco mais frágeis, chegando mesmo a coalescer, independente da concentração de bentonita avaliada.             Figura 1: Pellets resultantes da série 1: (a) recém-obtidos; (b) secos.   Este resultado também foi observado por Pasqualim et al., que relataram a deformação das micropartículas de alginato quando a capacidade de encapsulação do material foi excedida [9]. A figura 2 apresenta os valores de conídios encapsulados e, apesar do aumento da concentração de conídios na série 2, em ambas as séries não foi encontrada diferença significativa entre as quantidades inicial e final de conídios. Assim, à medida que a quantidade de material encapsulado aumenta, a espessura das micropartículas diminui e, portanto, sua resistência também. Isso justifica a instabilidade dos pellets obtidos pela série 2, os quais provavelmente também atingiram a capacidade de encapsulação da B. bassiana.     a) b) 12° Congresso Brasileiro de Polímeros (12°CBPol)  a)   b)  Figura 2: Quantidade de conídios encapsulados em (a) série 1; (b) série 2. Resultados expressos como média ± erro padrão e estudadas pela análise de variância (ANOVA) para múltiplas comparações utilizando-se nível de significância P<0,05.     A diferença entre os pellets das séries 1 e 2 refletiu também em sua capacidade de intumescimento, revelando menores valores de intumescimento para os pellets da série 2 (Fig. 3).   Figura 3: Comparação entre os índices de intumescimento (Ii%) das séries 1 e 2. Os pesos seco e após intumescimento foram expressos como média ± erro padrão e estudados pala análise de variância com dois fatores (Two-way ANOVA) com valor de P<0,001.    O semeio dos pellets em meio nutritivo na série 1 resultou em germinação miceliana a partir do quarto dia, em apenas uma placa (ab2) e ao redor de um único pellet (Fig. 4). Já para na série 2, esta germinação ocorreu a partir do segundo dia, ao redor de todos os pellets semeados e em todas as placas. Este resultado pode estar associado à alta concentração de conídios utilizada ou até mesmo a fragilidade da estrutura dos pellets ocasionada pela alta carga fúngica a que foi submetido o material.    Figura 4: Germinação miceliana a partir de pellets ab2 semeados em BDA     12dias 4dias 12° Congresso Brasileiro de Polímeros (12°CBPol)  Conclusão   O alginato de sódio é um biopolímero derivado do ácido algínico que tem a habilidade de formar de gel, retendo uma grande quantidade de água em seu interior sem que haja dissolução. É bastante utilizado em formulações farmacêuticas e tem sido amplamente aplicado em técnicas de microencapsulação, sendo altamente biocompatível e biodegradável. Sua associação a bentonita sódica, argila mineral, é promissora, já que resulta em um material nanocompósito com propriedades orgânicas e inorgânicas, capaz de potencializar a encapsulação de princípios ativos. O presente estudo evidenciou suas propriedades encapsuladoras para a biomassa fermentada de B. bassiana. A técnica de reticulação utilizando-se CaCl2 gerou pellets com capacidade de incorporar conídios, mesmo em grandes concentrações. Os pellets resultantes da suspensão com concentração mais baixa, série 1, resultou em valores mais altos de intumescimento, e, apesar deste ser um fator importante para prever a liberação dos esporos no meio ambiente, esta não ocorreu de forma satisfatória dentro das condições e período de tempo estudados. Nos experimentos da série 2 a capacidade de encapsulação do material foi provavelmente extrapolada, isso resultou em redução da estabilidade dos pellets e em índices de intumescimento menores, o que pode explicar a liberação rápida dos conídios fúngicos. Diante dos resultados obtidos, o nanocompósito mostrou ser uma potencial matriz para B. bassiana, no entanto, como perspectiva, concentrações intermediárias de suspensão fúngica devem ser avaliadas para se alcançar o equilíbrio entre a estabilidade dos pellets e a liberação modificada do fungo.  Agradecimentos  À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) e à Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas (Fapeal) pelo apoio financeiro.  Referências  1. J. M. S. Ferreira; D. R. N. Warwick; L.A. Siqueira in A cultura do coqueiro no Brasil, Embrapa – CPATC, Aracajú, 1998; ed. 2, 189-267. 2. D. Gallo; et al. in Manual de entomologia agrícola, Agronômica Ceres, São Paulo, 1988; ed. 2, 649. 3. S. B. Alves in Patologia e controle microbiano: vantagens e desvantagens, Controle microbiano de insetos - FEALQ. Piracicaba, 1998; 21-37. 4. J. Calero; et al. in Elaboración y Caracterización de Microcápsulas Gastrorresistentes de Diclofenac Obtenidas por Gelificación Iónica, Universitas, 2008; vol. 1, 27-30. 5. R. M. D. G. Carneiro; C. B. Gomes in Encapsulação do fungo Paecilomyces lilacinus em matrizes de alginato-argila e Avaliação e Viabilidade dos Conídeos em Duas Temperaturas, Nematologia brasileira, 1997; vol. 21, 85-92. 6. O. A. Cavalcanti; et al. in Polysaccharides as excipients for colon-specific coatings, permeability and swelling properties of casted films, Drug Dev, Ind. Pharm, New York, 2002; vol. 28, 157-164.  7. K. Moebus; J. Siepmann; R. Bodmeier in Alginate-poloxamer microparticles for controlled drug delivery to mucosal tissue, European Journ. of Pharm. and Biopharm., 2009; vol. 72, 42-53. 8. I. S. Melo; F. G. Costa in Desenvolvimento de uma Formulação Granulada a Base de Trichoderma harzianum para controle de fitopatógenos. Comunicado técnico 31 – Embrapa, São Paulo, 2005; ISSN 1516-8638.  9. S. S. Ray; M. Okamoto. Progress in Polymer Science, Elsevier, 2003; vol. 28, 1539. 10. P. Pasqualim; et al. in Microcápsulas de Alginato de Cálcio e Óleo Vegetal Pela Técnica de Gelificação Iônica: Um Estudo da Capacidade de Encapsulamento e Aplicação Dermatológica. Visão Acadêmica, Curitiba, 2010; vol. 11, 23-37. 

Formulações bioinseticidas de Beauveria Bassiana a base de nanocompósito polimérico visando o controle de praga do coqueiro.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/993041/1/Adenir.Resumocongresso.pdf

Formulações bioinseticidas de Beaveria Bassiana a base de nanocomposito polimérico visando o controle de praga do coqueiro.

Formulações bioinseticidas de Beaveria Bassiana a base de nanocomposito polimérico visando o controle de praga do coqueiro.

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