CORTÊS, G. L.

HELM, C. V.

LIMA, E. A. de

MAGALHAES, W. L. E.

PINTO, F. de S.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Screening test para avaliação de basidiomicetos quanto à síntese de celulases.

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SCREENING TEST PARA AVALIAÇÃO DE BASIDIOMICETOS QUANTOÀ SÍNTESE DE CELULASES*Gustavo Lozano Côrtes, .•..•.Fernanda de Souza Pinto, .•..•."Crísfíane Vieira Helm, .•..•."'Edson Alves deUma, *'*"Washington Luiz Esteves Magalhães*Graduando do Curso de Engenharia Industrial Madeireira da Universidade Federal do Paraná, Curitiba - Paraná, estagiário da EmbrapaFlorestas, Colombo - Paraná,*Graduanda do Curso de Engenharia Florestal da Universidade Federal do Paraná, Curitiba - Paraná, estagiária da Embrnpa Florestas,Colombo - Paraná,** Pesquisador da Embrapa Florestas, Caixa Posta1319, 83411-000, Colombo, PREmail:gustavo.cla.pioneiro@gmail.comResumoEste trabalho teve por objetivo avaliar a atividade da celulase de isolados de basidiomicetos. Dezenove isoladosda coleção de macrofungos da Embrapa Florestas foram analisados para avaliar seus potenciais quanto àprodução de celulases em resposta à presença de celulose como única fonte de carbono, em meio de cultura. Paraa síntese enzimática foi realizada primeiramente a produção de micélio em placas de Petri, com meio PDA eposteriormente transferidas para o meio Socarean contendo Avicel e CMC como fontes de carbono. Foi utilizadoo método qualitativo de coloração do indicador vermelho congo para a determinação do índice enzimático.Foram medidos os diâmetros dos halos de crescimento e de hidrólise após cinco dias de cultivo. Todos osisolados mostraram crescimento micelial nos diferentes substratos testados. Os que apresentaram o melhor índiceenzimático foram Xylaria globosa (1,3431), Perenniporia sp (1,3069) e Flaviporus venestus (1,3027). Contudo,sugere-se que estudos mais detalhados com os isolados, sejam realizados para avaliar se estes são potencialmentebons produtores de celulases, sob condições adequadas de cultivo.SCREENING TEST FOR THE EVALUATION OF BASIDIOMYCETES ACCORDING CELLULASEPOTEN11AL SYNTHESISAbstractThis work objective was to evaluate the cellulase activity from nineteen basidiomycetes isolates belonging to theEmbrapa Florestas col1ection macrofungi. Were analyzed their potentials towards celIulase production in aculture medium with just cellulose as a carbon source. Firstly were produced mycelia on Petri dishes forenzymatic synthesis in a PDA medium and then transferred for a Socarean medium with ceIlulose Avicel andCMC as the carbon sourees. The enzymatic index was qualitatively evaluated through colorimetric congo redmethod. After five cultivating days were measured the growth and hydrolysis baloes. All isolates sbowedmycelia growth on the distinct tested substrates. The best enzymatic indices were achieved by the isolatesXylaria globosa (1.3431), Perenniporia sp (1.3069), and Flaviporus venestus (1.3027). However, more detailedstudies are suggested for cellulase quantification using optimal cultivation conditions.IntroduçãoAlguns gêneros da classe dos fungos basidiomicetos são conhecidos por sua capacidade específica dedegradar a madeira pela ação de suas enzimas oxidativas (peroxidases e lacases) e hidrolíticas (beta-glicosidasese celulases) (Fernandes et al., 2005). Estes gêneros se desenvolvem em temperatura média de 30°C produzindouma série de enzimas ligno-celulases, que permitem degradar facilmente a lignina e a celulose da madeira, assimcomo outros substratos vegetais utilizados para o seu cultivo.Uma vez que diversos tipos de resíduos lignocelulósicos são gerados por processos industriais,exploração agricola e pela população das áreas urbanas. A biomassa, no geral, tem sido utilizada geralmentecomo combustível sólido em sistemas de reciclagem e produção de biocombustíveis (Baysal et aI., 2003).A biomassa lignocelulósica compõe mais de 60 % de todo o material vegetal produzido em terra. Esterecurso vasto é a fonte potencial de biocombustível, biofertilizantes, indústria de papel, rações animais esubstratos para produção de alimentos e a utilização racional de todo esse potencial através de processosquímicos ou biológicos é o grande salto na inovação tecnológica.Inserida dentro do Projeto Florestas Energéticas que busca soluções inovadoras para o uso racional dosresíduos florestais, o objetivo deste trabalho foi avaliar, através de uma triagem, os basidiomicetos da coleção deculturas da Embrapa Florestas, quanto ao potencial de síntese de enzimas celulolíticas tendo em vista a hidrólisede substratos de madeira na conversão a etano I de segunda geração. Com a crescente preocupação na obtençãode energia limpa e renovável, muitos trabalhos em bioenergia tem sido desenvolvidos com a finalidade de obter-se ganhos substanciais para o meio ambiente.Devido ao grande impacto ambiental que o uso contínuo de combustíveis fósseis apresenta, a produçãode etanol de 23 geração, a partir de materiallignocelulósico, tem sido muito explorada, mostrando um potencialambiental, econômico e social.A biomassa lignocelulósica, constituída principalmente por celulose, hemicelulose e lignina, pode sersubmetida a pré-tratamentos com a finalidade de facilitar a hidrólise enzimática que por sua vez pode converteraçúcares redutores em etanol. Entretanto, faz-se necessário o ajuste de melhores condições para obtenção de umpré-tratamento adequado, bem como a obtenção de enzimas hidrol.íticas com atividade alta e custo baixo, paraque todo o processo seja viável economicamente.Os fungos filamentosos da classe dos basidiomicetos, tem propriedades fisiológicas, enzimáticas ebioquímicas que os permitem se destacar entre os organismos que podem crescer em substratos lignocelulósicos.Os gêneros avaliados nesse estudo pertencem a classe dos basidiomicetos, compreendendo uma classe deorganismos com uma capacidade de degradar a madeira pela ação de suas enzimas oxidativas (peroxidases elacases) e hidrolíticas (beta-glicosidases e celulases) (Fernandes et al., 2005).Material e MétodosA Embrapa Florestas mantém uma coleção de trabalho de isolados de macrofungos em métodoCasteIlani. O método baseia-se na conservação dos isolados em frascos de vidro contendo água destilada,autoclavados a 121 ±1 °C, a 1 atm por 15 mín.Neste estudo foram selecionados 19 destes isolados para avaliar a produção de enzimas celulolíticas(Tabela 1).Para a realização do Screeníng Test e determinação do Índice Enzimático, primeiramente os isoladosforam transferidos assepticamente em capela de fluxo laminar, para Placas de Petri contendo meio PDA (Batatadesidratada 4g; dextrose 20g; Agar l5g; pH: 5.6± 0.2 a 25°C). Plugs foram colocados no centro das placas eincubadas em estufa à 25 ± 1°C, por 7 dias. O experimento foi realizado com 5 repetições.Após o crescimento e desenvolvimento micelial até atingir todo o diâmetro das placas de Petri, osfungos foram transferidos para placas de Petri contendo meio Socarean (meio sintético com carboximetilcelulose(CMC) e Avicel como únicas fontes de carbono (NaNG-i: 3,0 gr1 ; K2HP04: 1,0 gr1 ; MgS04: 0,5 gL" ; KCI:0,5 g'L-l ; FeS04 .7H~: 10,0 mgL" ; CMC: 5.0 grl pH: 5,0; ágar: 30,0 gr1 ; Avicel: 5.0 g'L-1 pH: 5,0). OAvicel e o CMC induzem os fungos a produzirem enzimas que degradam a celulose. Os inóculos foram obtidosdiscos no centro de placas de Petri. Os isolados foram mantidos em estufa a 25±1 DC, até obterem umcrescimento mínimo. A partir do momento em que obtiveram o crescimento adequado foram selecionadas trêsplacas com melhor desenvolvimento para o teste do vermelho do congo.Para o teste com vermelho do congo (C32H22N~a206S2) marcou-se em cada placa dois eixos aleatórios,esses eixos foram utilizados como referência para a medida do halo de crescimento e posteriormente para o halode hidrólise. Foram registrados os valores referentes aos diâmetros correspondentes a cada eixo. Posteriormente,foram adicionados 3 mL de solução do indicador vermelho congo 0,1% em cada uma das placas de Petricontendo os isolados. Após 15 minutos ter ocorrido a reação foi adicionado 3 mL de solução de NaCI 0,1 M. Ohalo fluorescente de coloração alaranjada foi observado em todas as placas. O diâmetro do halo foi medidoutilizando como referência os mesmos eixos que foram marcados na placa anteriormente. Os diâmetros dascolônias e os halos produzidos foram medidos com paquímetro digital e calculado o halo de hidrólise.Resultados e DiscussãoOs resultados obtidos após o cultivo dos fungos em meio sintético contendo CMC e AVICEL comoúnicas fontes de carbono e após a reação do teste qualitativo com o indicador vermelho do congo foi verificado aformação do halo de hidrólise na zona de degradação da celulose ao redor das colônias, correspondente ao haloindicador da degradação da CMC e do AVICEL, observada nos isolados de macrofungos selecionados. Paracomparar esses isolados, foi estabelecido Um índice enzimático. A visualização do halo dependeu de váriosfatores, como a composição do meio de cultura e foi um indicativo da síntese da enzima carboximetilcelulase(CMCase) pelos fungos avaliados (Tabela 2).Tabela 2 - Atividade da celulase de isolados de vários gêneros da coleção de macrofungos da EmbrapaFlorestas-Colombo,PR, cultivados em meio sintético com carboximetilcelulose e Avicel a 28 De. 0c = diâmetroda colônia (mm); 0h = diâmetro do halo (mm); Ind. Enz. = índice enzimático; N/A = não produziu enzima!enzima não detectada pdo teste.ReferênciasABREU, L.D.; MARlNO, RH.; MESQUlTA, J.B.; RIBElRO, o.r. Degradação da madeira de Eucalyptus sp,porbasidiomicetos de podridão branca. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.74, nA, p.32 1-328, 2007.BAYSAL, E; PEKER, H.; YALlNKlLIÇ, M.K.; TEMIZ, A . Cultivation of oyster mushroom on waste paperwith some added supplementary materiaIs. Bioresource Technology, v.89, n.l, p. 95-97,2003.FERNANDES, L.; LEITE, c.L.; ESPOSITO, E.; REIS, MM. In vitro wood decay of Eucalyptus grandis by thebasidiomycete fungus Phellinus flavomarginatus.Lnternational Biodeterioration & Biodegradation, v.55, p.187-193,2005. - ,NOGUEIRA, E.B.S.; CAVALCANTI, M.A.Q. Cellulolytic fungi isolated fromprocessed oats. Revista deMicrobiologia, v.27, p.7-9, 1996.NOVO INDUSTRI S.A. (Dinamarca). Celulose determination: Division Enzymes, N.AF 149/5, GB, 1978.WOOD, T.M.; GARCIA-CAMPAYO, V. Enzymology ofcellulosedegradation. Biodegradation, v.l, p. 147-161, 1990.

Screening test para avaliação de basidiomicetos quanto à síntese de celulases.

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