CARVALHO, E. V.

CASTRO, J. T.

COSTA, L. M.

KORN, M. das G. A.

NOGUEIRA, A. R. de A.

SANTOS, W. P. C.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

Quim. Nova, Vol. 29, No. 1, 149-152, 2006Nota Técnica*e-mail: lemalta@ig.com.brPLANEJAMENTO FATORIAL APLICADO À DIGESTÃO DE AMOSTRAS DE FEIJÃO ASSISTIDA PORRADIAÇÃO MICROONDASLetícia M. Costa*, Maria das Graças A. Korn e Jacira T. CastroDepartamento de Química Analítica, Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, Campus de Ondina, 40170-290Salvador-BAWagna P. C. SantosCentro Federal de Educação Tecnológica da Bahia, Salvador-BA e Departamento de Química Analítica, Instituto de Química,Universidade Federal da Bahia, Salvador-BAEdivan V. CarvalhoDepartamento de Química, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos- SP e Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos-SPAna Rita A. NogueiraEmbrapa Pecuária Sudeste, São Carlos-SPRecebido em 9/9/04; aceito em 13/5/05; publicado na web em 25/11/05FACTORIAL DESIGN EMPLOYED FOR MICROWAVE-ASSISTED DIGESTION OF BEAN SAMPLES. The use of factorialdesign was evaluated for optimization of focused-microwave-assisted digestion of bean samples. Calcium, Fe, Mg, Mn and Znpercentual recoveries were determined in digestates after focused-microwave-assisted digestion according to factorial designprocedures. A cavity microwave digestion was carried out to certify the elemental compositions obtained. The accuracy was checkedusing a standard reference material, the NIST SRM 8433 - Corn Bran. Results are in agreement with certified values at the 95%confidence limit when the Student t-test was used. Volumes of nitric and sulfuric acid, temperature, and the interplay between HNO3and H2SO4 initial volumes were significant variables according to P-values in the analysis of variance (ANOVA).Keywords: factorial design; bean; focused-microwave-assisted digestion.INTRODUÇÃOUma das conseqüências do desenvolvimento dos métodos ins-trumentais, incluindo automação na geração e aquisição de dados,foi a obtenção de uma grande quantidade de dados numéricos einformações. Neste contexto, a aplicação da quimiometria facilitaa interpretação de forma mais rápida e eficiente da crescente gamade dados originados de um sistema1. O planejamento fatorial é umaimportante ferramenta estatística e, devido a sua simplicidade, vemsendo cada vez mais utilizada pelos químicos analíticos2 para dife-rentes amostras e propósitos3-5, pois possibilita a interpretação dosresultados considerando todos os parâmetros experimentais envol-vidos, além de fornecer o efeito das possíveis interações entre asvariáveis selecionadas.A etapa de pré-tratamento da amostra envolve digestão, extra-ção ou preparação do analito antes da determinação6. Essa é a eta-pa mais morosa de toda a análise química, requerendo cerca de61% do tempo total necessário para emissão dos resultados, po-dendo ser ainda responsável por cerca de 30% do erro total da aná-lise7. A utilização da radiação microondas na etapa de pré-trata-mento da amostra reduz significativamente o tempo de preparo,além de contribuir para redução do branco analítico, pela utiliza-ção de menores volumes de reagentes ácidos, aumentar a seguran-ça do operador e reduzir os riscos de perdas de elementos voláteis,quando a digestão da amostra é realizada em frascos selados, sobaltas temperatura e pressão8.A associação de planejamento fatorial e procedimentos de di-gestão em fornos de microondas na etapa de pré-tratamento deamostra contribui na redução do trabalho laboratorial, além de ge-rar informações relevantes para mapeamento dos fatores que afe-tam o sistema dentro dos domínios estabelecidos.O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma leguminosa degrande consumo mundial, sendo o Brasil o maior produtor do gê-nero Phaseolus9. O feijão é uma leguminosa de grande importân-cia nutricional, apresentando-se como fonte de minerais essenci-ais, tais como, Ca, Cu, Fe, K, Mg e P10.Neste trabalho foi desenvolvido planejamento fatorial 23 paraotimização do programa de digestão de amostras de feijão em for-no de microondas com radiação focalizada. As determinações deCa, Fe, Mg, Mn e Zn foram realizada por ICP OES com configura-ção radial. Os resultados obtidos foram comparados aos encontra-dos empregando um procedimento de digestão em forno de micro-ondas com cavidade. Uma amostra de material de referência certi-ficado, NIST SRM 8433 - Corn Bran foi utilizada para verificaçãoda exatidão.PARTE EXPERIMENTALInstrumentaçãoPara determinação dos analitos após digestão em forno de mi-croondas com radiação focalizada foi utilizado um espectrômetrode emissão óptica com plasma acoplado indutivamente modelo ARL3410 mini tocha seqüencial, com visão radial (Fisons Instruments,EUA), instalado no IQ-UFBA, Salvador-BA. Para as determina-ções dos elementos dos digeridos provenientes do forno de micro-ondas com cavidade foi utilizado um espectrômetro de emissãoóptica com plasma acoplado indutivamente com visão radial (Vis-ta, Varian, Multigrave, Austrália), locado na Embrapa Pecuária150 Quim. NovaCosta et al.Sudeste em São Carlos-SP. A Tabela 1 ilustra as condições experi-mentais utilizadas para as determinações dos analitos.A digestão das amostras de feijão foi realizada no forno demicroondas com radiação focalizada com duas cavidades e ope-rando à pressão atmosférica (STAR 2, CEM, Matthews, N.C., EUA).Foi desenvolvido um procedimento para comparação e validaçãodos teores dos elementos estudados utilizando um forno de micro-ondas com cavidade e capacidade para 6 frascos de perflouroalcóxiTeflon® (PFA), equipado com sensores de pressão e temperatura(Multiwave, Anton Paar, Graz, Áustria).As amostras de feijão foram moídas em micro-moinho de fa-cas MA 630 (Marconi, Piracicaba, Brasil).Reagentes, soluções e amostrasTodas as soluções foram preparadas com reagentes de grauanalítico e os volumes finais ajustados com água destilada edeionizada. Todas as vidrarias foram previamente descontaminadasem banhos contendo 10% v/v HNO3 por 24 h. Soluções de referên-cia foram preparadas a partir de soluções estoque contendo 1000mg L-1 de Ca, Fe, Mg, Mn, Zn (Merck), no mesmo meio dos dige-ridos ácidos obtidos. Para digestão das amostras foram utilizadosHNO3 e H2SO4 concentrados e H2O2 30% m/v (Merck).As amostras de feijão foram adquiridas em supermercados lo-cais e após a etapa de moagem, as porções foram homogeneizadassendo passadas por peneira de 32 mesh e acondicionadas em sacosplásticos sob congelamento.Planejamento fatorial para digestão da amostra de feijão emforno de microondas com radiação focalizadaPara o processo de otimização da digestão em forno de micro-ondas com radiação focalizada foi proposto um planejamentofatorial em dois níveis 23. O programa de aquecimento foi realiza-do em quatro estágios em um tempo total de 22 min, conformeapresentado na Tabela 2. Os parâmetros avaliados foram volumesiniciais adicionados de HNO3 e H2SO4 concentrados e temperaturanos estágios 3 e 4, de maior incidência de radiação microondas.Para os volumes iniciais de HNO3 e H2SO4, os níveis inferiores esuperiores relativos às variações dos parâmetros experimentais fo-ram de 4,0 e 7,0 mL e 1,0 e 3,0 mL, respectivamente. A temperatu-ra máxima nos estágios 3 e 4 do programa de aquecimento foiselecionada para 170 oC, no nível inferior e 200 oC no nível superi-or. O ponto central das variáveis foi obtido pela média dos valoresinferiores e superiores de cada parâmetro. Foram digeridas cercade 500 mg de amostra e as soluções límpidas dos digeridos,transferidas para balão volumétrico de 25 mL. Todos os experi-mentos foram desenvolvidos em duplicata, de forma randômica, eno ponto central foram realizados experimentos em quadruplicata.Os dados experimentais foram processados empregando-se o pro-grama Statistica (Statistica for Windows, Statsoft, Inc, 1999. Tulsa,OK, EUA).Procedimentos de digestão em forno de microondas comcavidadeO programa de aquecimento utilizado para digestão das amos-tras de feijão em forno de microondas com cavidade está apresen-tado na Tabela 3. Para uma massa de cerca de 200 mg de amostra,pesada diretamente nos frascos reacionais, adicionou-se 2,0 mL deHNO3 concentrado e 1,0 mL de H2O2 30% m/v. Após resfriamento,os digeridos foram diluídos para 10 mL com água deionizada.RESULTADOS E DISCUSSÃOPlanejamento fatorialOs parâmetros experimentais selecionados para o planejamen-to fatorial 23 aplicado ao procedimento de digestão em forno demicroondas com radiação focalizada para as amostras de feijãoforam volume inicial de HNO3, volume inicial de H2SO4 e tempe-ratura da etapa de maior incidência de radiação microondas. O pla-nejamento fatorial foi desenvolvido nos níveis máximo e mínimo eo percentual de concordância de Ca, Fe, Mg, Mn e Zn foi a respos-ta avaliada após a execução dos experimentos, como ilustra a Ta-bela 5. A significância dos efeitos das variáveis e das possíveisTabela 3. Programa de aquecimento do forno de microondas comcavidade (Multiwave) e frascos fechados (temperatura máxima =190 oC)Etapa Potência  Tempo Potência Ventilação Descriçãoinicial (W) (min) final (W) (%)1 400 3 400 25 Pré-aquecimento2 850 6 850 25 Aquecimento3 1000 10 1000 25 Aquecimento4 0 15 0 100 ResfriamentoTabela 2. Programa de aquecimento utilizando forno de microondascom radiação focalizada (STAR 2, CEM)* Adição inicial de ácidos: HNO3 + H2SO4Etapa tramp T tpat. Reagente Alíquota(min) (°C) (min) (mL) (mL)1 5 95 2 1,0 HNO3 1,02 3 150 2 1,0 HNO3 1,03 2 * 3 - -4 - * 5 10,0 H2O2 1,0* Parâmetros variados durante execução do planejamento fatorial(volume inicial de HNO3 variando de 4,0 a 7,0 mL, volume inicialH2SO4 variando de 1,0 a 3,0 mL e temperatura nos estágios 3 e 4variando de 170 a 200 oC).Tabela 1. Parâmetros instrumentais para as medidas por ICP OESICP OES Fisons ICP OESVarian Vista RLPotência incidente (W) 650 1000Câmara de nebulização concêntrica ciclônicaNebulizador Meinhard ConcêntricoVazão do gás do plasma (L/min) 7,5 15Vazão do gás auxiliar (L/min) 0,81 1,5Vazão do fluxo carregador (L/min) 0,81 -Vazão gás de nebulização (L/min) 2,5 0,9Tempo de integração do sinal (s) 3 10Linhas espectrais (nm) Ca I 422,67 Ca II 317,933Fe II 238,20 Fe II 259,940Mg II 279,553 Mg II 279,800Mn II 257,610 Mn II 257,610Zn I 213,856 Zn I 213,857I: linha atômica II: linha iônica151Planejamento Fatorial Aplicado à Digestão de Amostras de FeijãoVol. 29, No. 1interações entre elas foi checada pela aplicação da análise devariância (ANOVA) e com base nos gráficos de Pareto (Figura 1).As informações obtidas após a construção de superfícies de res-posta, como ilustrado na Figura 2, também foram utilizadas nainterpretação dos resultados.Os valores de concentrações dos elementos Ca, Fe, Mg, Mn eZn encontrados nas amostras de feijão digeridas no forno de mi-croondas com cavidade foram de 833 ± 27; 49,0 ± 1,0; 1839 ± 15;18,7 ± 0,3; 37,8 ± 0,8 mg g-1, respectivamente. Os gráficos de Paretoe as superfícies de resposta foram construídos a partir dospercentuais de recuperação dos elementos após aplicação do pla-nejamento fatorial 23 e tomando-se como referência os valores de-terminados após digestão das amostras em forno de microondascom cavidade, sob altas temperatura e pressão. Segundo a análisede variância e pelos gráficos de Pareto, tem-se que a variável volu-me inicial de H2SO4 foi significativa para todos os elementos ava-liados e com efeito negativo, isto é, para menores volumes de H2SO4foram obtidos maiores percentuais de concordância dos elemen-tos, sendo que, para Zn e Ca essa foi a única variável significativa.A interação entre as variáveis volume de HNO3 e de H2SO4foi significativa para Mg, Mn e Fe, com um valor positivo associ-ado a ela. Isto significa que um aumento no volume da misturaácida oxidante com maior proporção de HNO3 em relação aoH2SO4 pode levar a maiores percentuais de recuperação para es-ses elementos.Para o Fe (Figura 1) a temperatura, a interação entre as variá-veis volume de HNO3 e de H2SO4 e o volume de H2SO4 foram asvariáveis significativas. A variável temperatura foi significativasomente para Fe, com um valor positivo associado, ou seja, maiorrecuperação é obtida com o aumento da temperatura da misturadigestora. Para Ca e Zn, teores de recuperação em torno de 70%foram encontrados nos digeridos do forno de microondas com ra-diação focalizada, quando comparados aos valores obtidos pelosistema de microondas com cavidade. A formação de sulfatos pou-co solúveis e a perda por volatilização, no caso do Zn, podem ex-plicar essa tendência. Possivelmente, esses teores seriam superio-res se houvesse a possibilidade de realização da digestão no siste-ma focalizado sem adição do ácido sulfúrico. Porém, como o siste-ma opera à pressão atmosférica, a utilização de H2SO4 é necessáriapara alcançar temperaturas superiores à temperatura de ebuliçãodo HNO3 (120 oC) e promover uma eficiente oxidação da matériaorgânica sem que ocorra a secura da mistura digestora evitando,assim, acidentes e/ou danos ao equipamento. Entretanto, sempreque possível, a utilização de menores volumes de H2SO4 em pro-gramas de digestão de amostras pode ser vantajosa, pois a baixaacidez dos digeridos propicia menores fatores de diluição, possibi-litando introdução direta em equipamentos, ampliando a possibili-dade de detecção dos elementos presentes e aumentando a vida útildos dispositivos ópticos e eletrônicos que sofrem ação direta dassoluções ácidas11.Validação dos resultadosPara a amostra certificada (NIST SRM 8433), os resultadosapós a digestão em forno com cavidade são apresentados na Ta-bela 4. Os valores encontrados concordam com os valores certi-ficados a um nível de confiança de 95%, empregando-se o testet-Student pareado.Os valores dos percentuais de recuperação de Ca, Fe, Mg, Mne Zn obtidos após o planejamento experimental, tomando comovalores de referência o procedimento de digestão em forno de mi-croondas com cavidade sob altas temperatura e pressão, são mos-trados na Tabela 5. O procedimento de digestão em forno de mi-croondas sob altas temperatura e pressão foi selecionado comométodo de referência por apresentar menor susceptibilidade a per-das por volatilização e contaminação, o que resulta em baixos va-lores de brancos analíticos. Os resultados apresentados na Tabela 5indicam uma faixa de recuperação variando de 74 a 90% para Ca,78 a 104% para Fe, 78 a 91% para Mg, 74 a 88% para Mn e 65 a84% para Zn, quando comparados aos valores obtidos após diges-tão em forno de microondas com cavidade. Os melhores percentuaisde recuperação dos elementos foram obtidos nas condições demenores volumes H2SO4. Os resultados alcançados após a digestãoem forno de microondas com radiação focalizada concordam comos valores obtidos no forno de microondas com cavidade a umnível de confiança de 95%, empregando-se o teste t-Student.Figura 1. Gráfico de Pareto do planejamento fatorial completo 23 obtidopara Fe (a linha vertical define 95% do intervalo de confiança)Figura 2. Superfície de resposta do planejamento fatorial completo 23 obtidopara Fe (-1,2: nível mínimo; 1,2: nível máximo; 0: ponto central)Tabela 4. Valores certificados e determinados de Ca, Fe, Mg, Mn eZn para a amostra NIST SRM 8433 – Corn Bran, digerida em fornode microondas com cavidadeElemento Valor certificado Valor encontradoCa 420 ± 38 415 ± 50Mg 818 ± 59 833 ± 12Mn 2,55 ± 0,2 02,4 ± 0,1Zn 18,6 ± 2,2 16,9 ± 0,3152 Quim. NovaCosta et al.CONCLUSÃOA utilização do planejamento fatorial indicou uma tendênciapara obtenção de resultados com melhores percentuais de recupe-ração. A variável volume inicial de H2SO4 foi significativa paratodos os elementos investigados. Porém, sua utilização em siste-mas que operam à pressão atmosférica é necessária para o aumen-to da temperatura acima do ponto de ebulição do ácido nítrico(120 oC), mas sua redução deve ser avaliada, pois permite a obten-ção de melhores percentuais de concordância para a amostra emestudo. A interação das variáveis volume de HNO3 e de H2SO4 apontapara um aumento no volume da mistura ácida oxidante para obten-Tabela 5. Porcentagem de recuperação de Ca, Fe, Mg, Mn e Znapós realização do planejamento fatorial 23EXP. HNO3 H2SO4 T % RECUPERAÇÃOZn Fe Mn Mg Ca1 - - - 84 91 85 91 902 + - - 83 85 81 85 863 - + - 70 81 74 78 774 + + - 75 81 75 78 765 - - + 84 104 88 90 856 + - + 78 92 81 85 857 - + + 73 78 78 84 808 + + + 74 98 81 81 789 0 0 0 77 95 82 86 8410 0 0 0 75 81 75 82 7411 - - - 83 89 84 87 8712 + - - 71 88 85 83 8313 - + - 69 82 74 80 7814 + + - 78 86 84 82 8215 - - + 81 99 85 88 8416 + - + 80 86 84 85 8717 - + + 76 78 74 82 8518 + + + 79 95 80 82 8019 0 0 0 80 85 81 85 8120 0 0 0 79 81 78 83 80ção de melhores recuperações para Fe, Mg e Mn. Neste caso, aredução do H2SO4 e concomitante elevação do volume de HNO3pode gerar condições reacionais favoráveis à digestão da matériaorgânica, com melhores recuperações desses elementos. O proce-dimento de digestão empregado na digestão da amostra de materi-al de referência certificado gerou resultados precisos e exatos. Osresultados evidenciam uma das principais vantagens da utilizaçãodo planejamento fatorial: a possibilidade de avaliar o sistema demaneira multivariada, buscando otimizar todas as variáveis quecompõem o sistema experimental.AGRADECIMENTOSÀ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia –FAPESB (PRONEX-CNPq-FAPESB – Processo número 40/03),CAPES e FINEP pelo suporte financeiro. Os autores L. M. Costa,E. V. Carvalho, M. G. A. Korn, A. R. A. Nogueira e J. T. Castroagradecem ao CNPq pelas bolsas concedidas.REFERÊNCIAS1. Pereira-Filho, E. R.; Poppi, R. J.; Arruda, M. A. Z.; Quim. Nova 2002, 25,246.2. Neto, B. B.; Scarminio, I. S.; Bruns, R. E.; Como fazer experimentos –pesquisa e desenvolvimento na ciência e na indústria, Ed. Unicamp:Campinas, 2001.3. Zhou, C. Y.; Wong, M. K.; Koh, L. L.; Wee, Y. C.; Anal. Chim. Acta 1995,314, 121.4. Martín-Garcia, M. B.; Bellido-Milla, D.; Jimenez-Jimenez, A.; Hernández-Artiga, M. P.; Fresenius J. Anal. Chem. 1999, 364, 527.5. Ferreira, S. L. 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Planejamento fatorial aplicado a digestão de amostras de feijão assistida por radiação microondas.

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