DIAZ, V. S.

FERRAZ, E. M.

IBAÑES, B.

KAGEYAMA, P. Y.

KESTRING, D. R.

MORENO, M. A.

SEOANE, C. E. S.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Extração de DNA genômico de amostras foliares de erva-mate armazenadas em sílica-gel.

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EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE AMOSTRAS FOLIARES DE ERVA-MATEARMAZENADAS EM SÍLICA-GELV.S. Diaz\ M.A.Morenol, E.M.Ferrazl, B.lbafiesl, D.R.Kestring2, C.E.S.Seoane2, P.Y.Kageyama'.lUniversidade de São Paulo - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (USP/ESALQ),Av. Pádua Dias, 11, CP 9, CEP 13418-900, Piracicaba, Brasil, vinicius.diaz@usp.br;amoreno@esalq.usp.br; emferraz@esalq.usp.br; bibanes@usp.br; kageyama@esalq.usp.br2Embrapa Florestas, Estrada da Ribeira, Km 111, CP 319, CEP 83411-000, Colombo, PR, Brasil,eduardo@cnpf.embrapa.br; drigoni@cnpf.embrapa.br.ResumoEstudos com marcadores moleculares em erva-mate (I/ex paraguariensis St. Hil.) podem serutilizados para diversas aplicações, desde estudos de genética de populações até programas demelhoramento. Para trabalhos de caracterização e diversidade genética é exigido um grandenúmero de indivíduos, necessitando de métodos confiáveis de armazenamento. Este trabalho'avaliou a viabilidade do método de armazenamento de material vegetal foliar em sílica-gel paraextração de DNA genômico de erva-mate, comparando quantidade e qualidade do DNA totalobtido de amostras conservadas a frio e de amostras conservadas em sílica-gel. O protocoloutilizado foi adaptado de Ferreira & Grattapaglia (1998), que consiste em: CTAB 3%, 1,4 NaCl,20mM EDTA, 100mM Tris-HCl pH 8,0, adicionado PVP 1,0%, B-mercaptoetanol 0,2%. Após 45dias de armazenamento foi possível extrair DNA das amostras foliares, com boa qualidade, semsinais de oxidação, rastro de proteína e RNA.Palavras-chave: preservação de amostras, análises moleculares, transporte de material,marcadores moleculares.EXTRACTION OF GENOMIC DNA SAMPLES OF LEAF YERBA MATE STORED INSILICA-GELAbstractStudies with molecular markers in yerba mate (I/ex paraguariensis St. Hil.) can be used forvarious applications, ranging from studies of population genetics to plant breeding. To work oncharacterization and genetic diversity is required a large number of individuals requiring areliable method of storage. This study evaluated the feasibility of the method of storage of plantleaf material in silica gel for extraction of genornic DNA of yerba mate comparing the quantityand quality of total DNA obtained from samples stored cold and samples preserved in silica gel.The protocol used was adapted from Ferreira & Grattapaglia (1998), which consists of: 3%CTAB, 1.4 NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, plus 1.0% PVP, O B-mercaptoethanol, 2%. After 45 days of storage was possible to extract DNA from leaf samples,with good quality, with no signs of rust, trace of protein and RNA.Keywords: preservation of samples, molecular analysis, material transport, molecular markers.IntroduçãoEstudos com marcadores moleculares em erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) podemser utilizados para diversas aplicações, desde estudos de genética de populações até programasde melhoramento. Para trabalhos de caracterização e diversidade genética é exigido um grandenúmero de indivíduos, necessitando de métodos confiáveis de armazenamento do materialvegetal. Sempre que possível é indicado o uso de material fresco, entretanto, em trabalhos compopulações nativas as amostras podem estar distante dos centros de pesquisa, levando por vezes6768tempo considerável de transporte até os laboratórios.A preservação de amostras em sílica-gel tem por vantagem conservar o material vegetal aum baixo custo, pois dispensa estruturas de refrigeração no transporte e no local dearmazenamento (Chase e Hills, 1991). Tecidos secos em estudos moleculares são rompidos commaior facilidade, além de serem menos suscetível à degradação química ou enziinática,preservando desta forma o DNA com qualidade. (Murray e Thompson, 1980). Vários estudosconfirmam a eficácia da sílica-gel como método de armazenamento. Moraes Filho (2010)comparou o uso de material conservado em sílica-gel e material fresco conservado a frio para ogênero Citrus, e verificou que não houve diferença significativa. Santos et al. (2007)) extraiuadequadamente DNA com material conservado em sílica-gel para a espécie Aniba rosaeodoraDucke (Pau-rosa). Stefenon e Nodari (2003) utilizaram com sucesso a sílica-gel para Araucária; eDe Almeida Vieira et aI. (2010) utilizou a sílica-gel para a extração de DNA da espécie Ficusbonijesulapensis. Entretanto, o uso deste método de conservação deve ser realizado com cautela,pois, como demonstrou Feres et al. (2005) a sílica-gel não foi eficaz para a obtenção de DNA dealta qualidade em folhas de plantas de várias espécies coletadas no cerrado ou campos rupestres.Estes estudos demonstram a necessidade de realizar estudos prévios da viabilidade daaplicação do método. A técnica de conservação em sílica-gel, quando viável, é uma importanteferramenta para estudos populacionais, sendo adequada a condição de trabalho de campo por serde simples execução; e ideal para o transporte por não necessitar de equipamentos derefrigeração.O presente trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade do método dearmazenamento de material vegetal foliar em sílica-gel para extração de DNA genômico de erva-mate.MetodologiaO presente trabalho foi desenvolvido no laboratório de Biologia Reprodutiva e Genéticade Espécies Arbóreas da Universidade de São Paulo - Escola Superior de Agricultura Luiz deQueiroz (USP/ESALQ). As amostras foliares foram coletadas de 11 indivíduos adultos de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) no município de Colombo, estado do Paraná. As amostrasffoliares de cada árvore foram armazenadas em sílica-gel e também foram mantidas frescas pormeio de refrigeração de aproximadamente 05 "C, Após 15 e 45 dias de armazenamento foirealizado o primeiro e segundo teste de extração de DNA genômico. Foi comparada a quantidadee qualidade do DNA total obtido do material foliar conservado a frio e do material armazenadoem sílica-gel,O protocolo utilizado foi adaptado de Ferreira & Grattapaglia (1998), que consiste em:CTAB 3%, 1,4 NaCl, 20mM EDTA, 100mM Tris-HCl pH 8,0, adicionado PVP 1,0%, 13-mercaptoetanol 0,2%. Para extração de DNA genômico das amostras foliares foi utilizadoaproximadamente 100 mg de tecido vegetal. As amostras foram acondicionadas em micro tubosde 1,7 ml e maceradas com auxílio de nitrogênio líquido. Em seguida foi adicionado 700 111detampão de extração. Os microtubos foram incubados no banho-maria à 65°C por uma hora, sendoagitados manualmente a cada 10 minutos. Após essa etapa, os microtubos foram resfriados atétemperatura ambiente, e foi adicionado 600 111de clorofórmio-álcool isoamílico na proporção de24:1. Posteriormente foram agitados e centrifugados por 10 minutos a 13.000 rpm, e osobrenadante, de aproximadamente 400 111foi transferido para um novo microtubo. Em seguidafoi adicionado 400 111de isopropanol e o material foi armazenado em freezer a -20°C por 12horas. Posteriormente foi centrifugado durante io minutos a 13000 rpm para formação dospellets. O sobrenadante foi descartado e os pellets foram lavados por duas vezes a 500 111deetanol 70%, e por uma vez a 500 111de etanol 95%. Retirado o etanol os microtubospermaneceram à temperatura ambiente sobre a bancada por aproximadamente 05 horas parasecagem. Os pellets foram ressuspendidos com 60 111de tampão TE (10 mM Tris- HCl, 1 mM deEDTA, pH 8,0) acrescido de RNAse (15 mg / m1) e incubados a 37°C por uma hora. Após essaetapa, as amostras foram armazenadas a -20°C.A quantificação do DNA foi realizada por meio da análise comparativa com amostras deconcentração conhecida (À.) de 50 ~1, 100 ~1 e 300 ul. O DNA das amostras e os À foramsubmetidos à e1etroforese durante 30 minutos em ge1 de agarose a 1% corado com brometo deetídio e visualizado sob luz ultravioleta.Resultados e DiscussãoDe acordo com apresentado nas figuras 1 e 2, foi possível extrair DNA de boa qualidadedo material conservado em sílica-gel. As amostras não apresentaram sinais de oxidação, rastrosde proteína e RNA. A principal diferença entre os dois períodos de armazenamento foi aquantidade de DNA obtido, menor para o período de armazenamento de 45 dias. Os resultadosindicam que a sílica-gel é uma técnica viável de armazenamento de amostras foliares para a erva-mate. A escolha do método de armazenamento deve considerar o tempo entre a coleta e otransporte ao centro de pesquisa. Nesse sentido, a técnica de conservação em sílica-gel é .adequada a condição de trabalho de campo onde o transporte até os laboratórios podemnecessitar de um tempo considerável. Para coleta em locais próximos, onde é menor esseintervalo de tempo, o uso de material fresco é mais indicado.Figura 2: gel de quantificação de amostrasFigura 1: gel de quantificação de amostras com 45 dias de armazenamentocom 15 dias de armazenamentoConclusãoFoi possível extrair DNA genômico sem sinais de oxidação, rastro de proteína e RNA dasamostras armazenadas em sílica-gel.AgradecimentosAo CNPq pela bolsa de mestrado do primeiro autor, processo 14725112010-9.ReferênciasAlmeida Vieira, F; Da Silva Santana J. A.; Dos Santos, R. M. Métodos de extração de DNA eseleção de primers de cpDNA para Ficus bonijesulapensis (Moraceae), Revista Caatinga, v.23, n. 4, p.69-74. 2010.Chase, M.; Hills, H. Silica-gel - an ideal material for field Preservation of leaf samples for DNAstudies. Taxon, v. 40, n. 2, p. 215-220, 1991.Feres, F.; Souza, A. P.; Amaral, M. c.; Bittrich, V Evaluation ofmethods ofNeotropical Savanna6970plant samples preservation for yielding high quality DNA for molecular studies. RevistaBrasileira de Botânica, v. 28, p. 277-283, 2005.Ferreira, M.E.; Grattapaglia, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análisegenética. 3. ed. Brasília:EMBRAPA-CENARGEN, 220p.1998.Moraes-Filho, R M.; Jimenez, H. J.; Martins, L. S. S.; Montarroyos, A. Y. Y.; Musser, R S.;Ferreira da Silva, E.; Moura da Silva, M. Estudo comparativo entre protocolos de extração deDNApara o gênero Citrus. Star, v.l, p.6-8, 2010.Murray, M. G; Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. NucleicAcids Research, v. 8, n. 19, p.4321, 1980.Novaes, R; Rodrigues, J.; Lovato, M. An efficient protocol for tissue sampling and DNAisolation from the stem bark of Leguminosae trees. Genetics and Molecular Research, v. 8, n.1, p. 86-96,2009.Santos, R. P.; Angelo, P. C. D. S.; Quisen, R. C.; Oliveira, C. L.; Sampaio, P. D. T. B. RAPD emPau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke): adaptação do método para coleta de amostras in situ,ajuste das condições de PCR e apresentação de um processo para selecionar bandasreprodutíveis. ActaAmazonica, v. 37, n. 2, p.253-259. 2007.Stefenon, V M.; Nodari, R O. Marcadores moleculares no melhoramento genético de araucária.Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento. Edição n°, v. 31, p. 95, 2003.

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Extração de DNA genômico de amostras foliares de erva-mate armazenadas em sílica-gel.

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