Os fungos ectomicorrízicos (ECM) têm sido utilizados na produção de mudas florestais de qualidade. Neste trabalho, levantou-se a hipótese de que estes microrganismos também auxiliariam na degradação de moléculas orgânicas de pesticidas (xenobiontes) registrados no setor florestal. Este trabalho teve como objetivo avaliar a tolerância de fungo ectomicorrízico em exposição ao herbicida glifosato. O xenobionte atrasou o desenvolvimento do fungo ECM-Un01, no entanto a dose testada não foi suficiente para impedir seu desenvolvimento posterior. Existem, portanto, indícios do isolado ECM-Un01 ser tolerante ao glifosato, na dose utilizada.Resumo expandido

AUER, C. G.

FARIA, Á. B. de C.

MONTEIRO, P. H. R.

ÂNGELO, A. C.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Estudo sobre a viabilidade de remediação de pesticidas por ectomicorrizas e avaliação da sua tolerância em exposição ao glifosato.

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   Pedro Henrique Riboldi Monteiro(1);  Álvaro Boson de Castro Faria(2); Celso Garcia Auer(3); Alessandro Camargo Ângelo (4).  (1) Estudante de pós-graduação; Centro de Ciências Florestais e da Madeira; Universidade Federal do Parana - UFPR; Rua Lothário Meissner, 632, Curitiba, CEP: 80210-170, Jardim Botânico. rmonteiro.ef@gmail.com; (2) Professor Efetivo, Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus da UTFPR, Dois Vizinhos, PR, CEP: 85.600-000 alvarob@utfpr.edu.br; (3) Pesquisador da Embrapa Florestas, Estrada da Ribeira km 111, Colombo, PR, 83.411-000, auer@cnpf.embrapa.br; (4) Professor Adjunto, Universidade Federal do Paraná, Campus da UFPR, Curitiba, PR, CEP: 80.210-270, alessandro.angelo@ufpr.br;  RESUMO– Os fungos ectomicorrízicos (ECM) têm sido utilizados na produção de mudas florestais de qualidade. Neste trabalho, levantou-se a hipótese de que estes microrganismos também auxiliariam na degradação de moléculas orgânicas de pesticidas (xenobiontes) registrados no setor florestal. Este trabalho teve como objetivo avaliar a tolerância de fungo ectomicorrízico em exposição ao herbicida glifosato. O xenobionte atrasou o desenvolvimento do fungo ECM-Un01, no entanto a dose testada não foi suficiente para impedir seu desenvolvimento posterior. Existem, portanto, indícios do isolado ECM-Un01 ser tolerante ao glifosato, na dose utilizada.  Palavras-chave: biorremediação; defesa fitossanitária; manejo integrado.  INTRODUÇÃO - O glifosato é um herbicida bastante utilizado no controle das plantas daninhas, que competem por água, luz e nutrientes na implantação de florestas de produção. A persistência residual e a degradação de pesticidas no solo dependem da ação dos microrganismos presentes, e que se alimentam das estruturas orgânicas destas moléculas (Faria, 2009). Uma atenção considerável tem sido dada no uso de plantas para remediar solos contaminados com metais e Poluentes Orgânicos Persistentes (POPs) (Meharg e Cairney, 2000). A biorremediação é uma área da biotecnologia ambiental e que pode ser definida como a aplicação de processos biológicos para o tratamento da poluição (Gadd, 2001). Muitos trabalhos tem se concentrado sobre o uso de bactérias, mas há uma clara desvalorização do potencial do envolvimento dos fungos na biodegradação (Gadd, 2001).  Os fungos ectomicorrizicos (ECM), por vezes presentes nas raízes de Pinus spp. e Eucalyptus spp., contribuem com a produção em biomassa vegetal. Segundo Meharg (2001), as enzimas produzidas por ECM, como lacases, tirosinases, oxidases e peroxidases são pouco seletivas sobre os POPs, indicando que ECMs poderiam degradar estes poluentes. A vantagem dos fungos é que seu crescimento micelial maximiza, tanto fisicamente quanto mecanicamente a ação enzimática, em contato com o ambiente (Maloney, 2001).  Entende-se por rizorremediação (ou fitoestimulação) a capacidade que as raízes de certas plantas apresentam em estimular a ação de microrganismos degradadores de poluentes no solo. Estas e outras técnicas como fitoextração, fitotransformação e fitoestabilização estão entre as classes de fitorremediação (Pilon-Smits, 2005). Quando a atividade remediadora ocorre na rizosfera e não na planta propriamente, é preferível usar o termo rizorremediação ao invés de fitorremediação (Meharg e Cairney, 2000). Os organismos remediadores devem, no mínimo, preencher três requisitos importantes (Meharg, 2001). O poluente deve estar biodisponível para o organismo remediador, este deve ser tolerante ao poluente presente nas concentrações encontradas no sítio a ser corrigido. Por fim, os organismos devem possuir a capacidade enzimática para degradar os poluentes de interesse (Meharg, 2001).  Apesar de estudos de laboratório terem mostrado a viabilidade, testes de campos sobre rizorremediação são praticamente inexistentes (Meharg, 2001). Ainda se conhece pouco sobre a diversidade funcional das enzimas das ECM (Cabello, 2001; Finlay, 2005), e os mecanismos de degradação de poluentes por ECM ainda são pouco conhecidos (Meharg e Cairney, 2000).  As interações de micorrizas com organismos do solo são inevitáveis, mas foram muito pouco estudadas (Meharg e Cairney, 2000; Perez-Moreno e Read, 2004; Finlay, 2005). Em condições naturais, ainda não é claro qual a prevalência da fonte nutricional das ECM, se são as plantas hospedeiras ou a matéria orgânica do solo (Treseder et al., 2006). Dentre as novas tendências ao se pesquisar micorrizas, destacam-se os estudos sobre a interação do micélio extra-radicular com substratos orgânicos e inorgânicos do solo (Finlay, 2005). Considerando que existem mais de seis mil espécies de Estudo Sobre a Viabilidade de Remediação de Pesticidas por Ectomicorrizas e Avaliação da sua Tolerância em Exposição ao Glifosato - FERTBIO 2012 Maceió (AL), 17 a 21 de setembro- - Resumo Expandido -  2fungos ECM, é provável que exista uma considerável variação fisiológica entre os diferentes isolados de uma única espécie (Meharg e Cairney, 2000). No Brasil, os levantamentos de espécies vegetais e fúngicas, nativas e ectomicorrízicas são incipientes, sugerindo a urgência em se identificar os recursos genéticos disponíveis e o papel da simbiose ectomicorrízica nos ecossistemas do cerrado, nas florestas nativas e nos plantios com espécies exóticas (Costa et al., 2003). Neste trabalho, levanta-se a hipótese na qual a inoculação de microrganismos no solo, poderia favorecer a remediação do herbicida glifosato, registrado para uso florestal. Para que um fungo ECM exerça atividade remediadora a um herbicida, é primordial que seja tolerante ao mesmo. Este trabalho teve como objetivos analisar a viabilidade de remediação de pesticidas por ECM e avaliar a tolerância do fungo ectomicorrízico (ECM-Un01) em exposição ao herbicida glifosato.  MATERIAL E MÉTODOS- O estudo foi realizado nos Laboratórios de Proteção Florestal e de Solos, Departamento de Engenharia Florestal da Unicentro, em Irati/PR, localizado nas coordenadas 25º27'56" S e 50º37'51" W.   A coleta de fungos micorrízicos (solo micorrizado) foi efetuada com base no método descrito por Inoue (1972). O solo foi coletado sob uma árvore de Pinus taeda L., situada nas imediações do Campus e as micorrizas confirmadas pelo exame externo das raízes. O material foi armazenado em refrigerador até o momento de sua utilização. O isolamento do fungo foi feito por meio da inserção de fragmentos de ectomicorrizas em placas de Petri com meio Agar-Batata-Dextrosado (BDA), na câmara de fluxo laminar. As placas continham entre 20 e 25 mL de meio de cultura. Posteriormente, as placas foram acondicionadas na câmara BOD, com temperatura ajustada para 28 ºC, com fotofase de 12 horas. Durante três meses, as placas com isolados do ECM-Un01 foram mantidas para desenvolvimento do micélio (produção de inoculante), e posterior inoculação no teste experimental. Após a inoculação das placas com o isolado ECM-Un01, utilizou-se uma seringa para aplicar um mL de glifosato (Glifosato Nortox®1) concentrado sobre a placa, sendo então fechada hermeticamente. Como testemunha, a inoculação foi realizada em uma placa de Petri, sem a aplicação do herbicida. Novamente, as placas foram colocadas em câmara BOD com temperatura ajustada para 28 ºC e fotofase de 12 horas de iluminação.  As avaliações foram realizadas aos 14, 28 e 42 dias após a aplicação do glifosato. Fotografias foram tomadas com o uso da máquina modelo Nikon L100. Trabalhos de edição de imagens foram executados no software Picture Manager e no PhotoPhiltre 6.4.0, a partir da função de correção automática de cor e brilho da imagem. As fotos                                                         1 Formulação comercial do herbicida autorizada para uso florestal no estado do Paraná (Andrei, 1999; Paraná, 2009). permitiram evidenciar o processo de colonização dos microrganismos nas placas. O ensaio foi montado em delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições (placa de Petri com meio de cultura).   RESULTADOS E DISCUSSÃO- Analisando-se a testemunha verificou-se que houve a colonização da placa pelo micélio do fungo, ocupando a maior parte de sua superfície. O ritmo de crescimento foi semelhante ao observado antes do experimento, no processo de produção do inoculante. As cores escuras evidenciam o micélio da ECM (Figura 1).   3a Avaliação - 42 DAT*  *DAT: Dias após o tratamento. Figura 1 – Crescimento micelial do isolado ECM-Un01 em meio BDA sem glifosato (testemunha).  Nas placas onde foi aplicado o herbicida, notou-se que as hifas tiveram um pouco mais de dificuldade de iniciar seu desenvolvimento em meio de cultura, mas o xenobionte não impediu a colonização (Figura 2). Na terceira avaliação, foi possível notar que o xenobionte atrasou o desenvolvimento da ECM-Un01, e a colonização não ocupou toda a superfície das placas, como verificado na testemunha. No entanto, a dose (1 mL) não foi suficiente para impedir o desenvolvimento posterior, aos 42 dias de cultivo (Figura 2). Pode ser afirmado, portanto, que a ECM-Un01 foi tolerante ao glifosato, na dose testada.     1ª Avaliação (14 DAT)           - FERTBIO 2012 Maceió (AL), 17 a 21 de setembro- - Resumo Expandido -  32ª Avaliação (28 DAT)   3ª Avaliação (42 DAT)  Figura 2 – Crescimento micelial do isolado ECM-Un01 em meio BDA contendo glifosato.  A eficiência de degradação vai depender de uma série de fatores, incluindo as taxas de crescimento de fungos, as condições de cultura, tempo de incubação e de nutrientes (Meharg e Cairney, 2000). A concentração de propágulos no solo também será um fator determinante na eficiência da remediação (Cabello, 2001). Meharg (2001) sugere que a rizosfera ideal deve ser resistente a vários poluentes. As enzimas de ECM são excretadas extracelularmente (Meharg, 2001). Para Cabello (2001), os estudos sobre rizorremediação devem focar quais exsudatos são produzidos pelas raízes das plantas. Meharg e Cairney (2000) mencionam que a degradação do herbicida 2,4D por micorrizas foi maior quando estavam em simbiose com plantas, em relação aos fungos ECM no solo.  O estudo de Treseder et al. (2006) sugere que a maior parte do carbono das ECM são adquiridos das árvores hospedeiras, não da matéria orgânica do solo. Para se comprovar a viabilidade na remediação do glifosato por ECM em campo, há que se levar em conta o argumento de Cabello (2001), no qual os fungos resistentes devem ser isolados de sítios contaminados. Os estudos propostos são importantes para a elaboração de teorias na sustentabilidade agrícola e florestal (Finlay, 2005). Para Meharg (2001), as áreas remediadas não deixarão de fornecer posteriormente recursos madeireiros ao produtor florestal. Nesta linha de raciocínio, Meharg e Cairney (2000) lembram que as técnicas silviculturais devem ser consideradas para otimizar a remediação, mas ainda existem poucos exemplos de aplicação prática. Os usos de tecnologias de biorremediação estão em fase inicial, mas a idéia é válida para situações em que o sítio permita a recuperação do solo no longo prazo (Meharg, 2001). Para Meharg e Cairney (2000), a rizorremediação possui como vantagem potencial o baixo custo e o baixo distúrbio no solo que se quer descontaminar. Este merece ser repetido com diferentes dosagens de glifosato, buscando quantificar a taxa de crescimento micelial da ECM-Un01 nas placas, para esclarecer qual o nível de exposição ao glifosato que promove uma toxicidade aguda.  CONCLUSÕES- Houve desenvolvimento do isolado ECM-Un01 em meio de cultura com glifosato. Existe viabilidade de remediação de pesticidas por ECM e o isolado ECM-Un01 é tolerante ao glifosato, na dose utilizada.  REFERÊNCIAS ANDREI, E. Compêndio de defensivos agrícolas. 6. ed. São Paulo, Andrei. 1999, 672 p.  CABELLO, M. N. Mycorrhizas and hydrocarbons. In: GADD, G.M. (org.). Fungi in Bioremediation. Oxford, Cambridge University Press. p. 456-471, 2001.  COSTA, M. D.; PEREIRA, O. L.; KASUYA, M. C. M.; BORGES, A. C. Ectomicorrizas: a face oculta das florestas. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento. 29: 39-46, 2003.  FINLAY, R. D. Mycorrhizal symbiosis: myths, misconceptions, new perspectives and future research priorities. Mycologist. 19: 90-95, 2005.  FARIA, A. B. C. Revisão sobre alguns grupos de inseticidas utilizados no manejo integrado de pragas florestais. Ambiência. 5: 345 – 358, 2009.  GADD, G.M. Preface. In: GADD, G.M. (org.). Fungi in Bioremediation. Oxford, Cambridge University Press. p. xi-xiii, 2001.  INOUE, M. T. Ensaio comparativo para dimensionar as influências causadas pela inoculação de fungos micorrízicos em mudas de Pinus taeda L. em relação à quantidade de inóculo presente no solo. Floresta, 4: 63-68, 1972.   MALONEY, S.E. Pesticide degradation. In: GADD, G.M. (org.). Fungi in Bioremediation. Cambridge University Press (ed.). p. 188-223, 2001.  MEHARG, A.A. The potential for utilizing mycorrhizal associations in soil bioremediation. In: GADD, G.M. (org.). Fungi in Bioremediation. Cambridge University Press (ed.). p. 445-455, 2001.  MEHARG, A.A.; CAIRNEY, J.W.G. Ectomycorrhizas – extending the capabilities of rhizosphere remediation? Soil Biology & Biochemistry, 32: 1475-1484, 2000.  PARANÁ. Agrotóxicos no Paraná. Secretaria da Agricultura e do Abastecimento do Paraná (SEAB) (Org.). Disponível em <http://celepar07web.pr.gov.br/agrotóxicos/pesquisar.asp>. Acesso em março de 2009.  PEREZ-MORENO, J.; READ, D.J. Los hongos ectomicorrízicos, lazos vivientes que conectan y nutren a los árboles en la naturaleza. INCI, 29: 239-247. 2004.  PILON-SMITS, E. Phytoremediation. Annual Review of Plant Biology. 56: 15-39, 2005.   TRESEDER, K.K.; TORN, M.S.; MASIELLO, C.A. An ecosystem-scale radiocarbon tracer to test use of litter carbon by ectomycorrhizal fungi. Soil Biology & Biochemistry. 38: 1077–1082, 2006. - FERTBIO 2012 Maceió (AL), 17 a 21 de setembro- - Resumo Expandido -  4 

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